ここでは、市販のブロイラー系統であるRoss PM3の卵から無菌のひよこの生成方法について説明する。この方法は、他の家禽種からの無菌動物の生成に適合させることができる。
宿主の生理機能および免疫能力に対する腸内微生物叢の寄与の研究は、ゴールドスタンダードと考えられている無菌動物モデルの利用可能性によって促進される。巣作りの鳥は、無菌条件下で親戚を育てる必要がないため、無菌動物の生産に理想的なモデルです。無菌ニワトリは、主に特定の病原体フリー(SPF)実験ラインから生成され、商業ニワトリラインの代表性はあまりありません。ここで提案された方法は、家禽産業で一般的に使用されている急成長しているブロイラーラインRoss PM3から無菌鶏を生産することを可能にしました。卵はブロイラーブリーダー農場で産卵した後すぐに集められました。彼らは、無菌卵孵化アイソレーターでの収集から導入まで、厳格な除染プロセスを受けました。ひよこは孵化され、それらの無菌性を制御するために必要な期間中、これらの無菌アイソレータに保管されています。もともと実験的なSPFホワイトレッグホーンライン用に開発された現在のプロトコルは、Ross PM3ブロイラーラインだけでなく、ウズラにも適応されています。したがって、それは経済的、生物学的または生態学的関連性のある他の家禽種および営巣鳥に堅牢で容易に適応可能な手順を表す。
動物の健康に対する腸内微生物叢の寄与に関する科学的および一般的な関心が劇的に増加しています。動物の腸内の異なるニッチに生息する細菌、ウイルス、真菌、および古細菌からなる微生物叢は、哺乳類種だけでなく家禽などの家畜にも影響を及ぼす炎症性、感染性および代謝性疾患の調節に直接的または間接的に関与している1。健康と病気に対する腸内微生物叢の寄与をよりよく研究するために、いくつかの動物モデルが開発されました。例えば、無菌および膠着性動物は、感染症の生理病理学に関する微生物または既知の微生物叢の完全な不在の研究を可能にする2,3。しかし、これらの動物を生産および維持するには、特殊な技術と設備が必要であり、それらを維持するために必要なコスト、労力、およびスキルは、多くの研究者へのアクセスを制限します。実際、無菌動物は、細菌培養法、顕微鏡検査、血清学、肉眼形態学、およびシーケンシングベースの検出技術の組み合わせを使用して、汚染の可能性について定期的に監視する必要があります。同様の手順は、家畜などの他の種にも適用され、動物は一般的に大きく、繁殖と維持のためにより大きな施設を必要とし、微生物叢の研究をある程度妨げる可能性があります。
家禽、より具体的には鶏は、世界中の家畜生産の礎石であり、群れの人口は年間400億羽を超える可能性があります。それは世界で最も重要な動物性タンパク質源です(http://www.fao.org/poultry-production-products/en/)。さらに、鶏の飼育や消費に関連する文化的または宗教的タブーはありません。この家禽腸内微生物叢は、動物の成長、飼料転換率、免疫、病原抵抗性、他の多くの栄養学的、生理学的または病理学的プロセスの中でも重要に関与している4。したがって、無菌ニワトリの生成は、微生物叢とその宿主との間の対話を強調するために不可欠である4。たとえ微生物群集が鶏卵管5に生息していたとしても、健康な鶏が産みたての卵の含有量は、微生物、卵殻、および微生物の侵入を避けるための機械的障壁を有する膜がほとんどない4。さらに、ひよこは親戚がいなくても簡単に飼育され、哺乳類とは異なり、無菌条件下で親が飼育することなく無菌動物を生産することができます。
実験施設「農場、モデル、野生動物の感染学」(PFIE、UE-1277、フランス、ヌージーリー、https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12)は、フランス国家インフラネットワークEMERG’IN(https://www.emergin.fr/)の一部です。PFIEは、40年以上にわたり様々な実験的研究を行うために無菌ニワトリの生産を習得してきました 7,8,9,10,11.これらの動物は、1970年代から閉鎖繁殖で飼育された白いレッグホーン産卵系統からの特定の病原体フリー(SPF)卵から産生された。主に微生物学的研究7,8,9に使用されている無菌鳥は、行動13に対する腸内微生物叢の寄与13、栄養利用14、免疫発達15および内分泌活性などの質問を伴う関心の復活を経験している。無菌ブロイラー系統16を用いていくつかの研究が発表されたとしても、これらの研究は実験層系統を用いた研究と比較して過小評価されたままである。微生物叢と家禽の健康と福祉における宿主との間のクロストークに向けた科学的疑問の進化は、世界で最も利用されているブロイラーチキンラインであるロスPM3ラインの無菌ブロイラーを生産するために私たちの歴史的なプロトコルを適応させることにつながりました。
無菌ニワトリを生成するためのいくつかの方法は、以前に記載されている7、21、22。ここで紹介したような簡単な方法は、異なる消毒剤を使用して、卵表面およびアイソレータ内の細菌負荷を低減する。最も一般的に使用される消毒剤は、塩化水銀、第四級アンモニウム、ヨードホルム、次亜塩素酸ナトリウムおよび二酸化塩素溶液である。結果はしばしば満足のいくものです。しかし、これらの方法のアクセシビリティにもかかわらず、この方法を適用して動物を大規模に飼育できる構造はほとんどないため、無菌ニワトリの利用は比較的まれなアプローチであり、非常に具体的な科学的問題に対処するためにのみ使用されます。ここで説明する方法、材料および装置は、少なくとも3週間(それらが生産された科学的実験の期間)健康で無菌のままである無菌ブロイラーの非常に効率的な孵化率を可能にする。
結果は、商業養鶏場で収集された卵からの無菌のひよこの生産へのプロトコルの適応が成功したことを示しています。SPF産卵の経験は、孵化効率が主に産卵鶏の年齢と収集された卵の品質に依存することを明らかにしています。両方のパラメータは、農場が選択され、卵が収集されたときに考慮されました。同じ方法を使用して、無菌ブロイラーの平均孵化率は、動物の不妊症(87%対83%)に影響を与えることなく、私たちの施設でのSPF産卵鶏の最後の生産(79%対35%)で得られたものよりもはるかに優れています。これらの違いは、鳥類の遺伝的背景(ブロイラー対層)と、40年以上にわたって閉鎖飼育されているSPF動物の卵においてより壊れやすい可能性が高い卵殻の品質に関連している可能性がある。さらに、我々はまた、2時間以上の輸送(農場から実験施設まで)が孵化効率と品質に影響を及ぼさないことも示している。
アイソレータの孵化に使用される滅菌プロセスと卵除染のプロトコルは最適化されましたが、アイソレータの約10%は無菌ではありませんでした。汚染の原因を理解するためには、卵の導入前に孵化したアイソレータの日常的な無菌制御を行うことが非常に重要です。
鳥類の無菌状態については、糞便サンプルから好気性および非堅固な嫌気性細菌の増殖を可能にする方法を適用し、生きた生存可能な細菌を検出していることを確認しました。これらの方法は、無菌性試験のための国際薬局方に準拠しており、日常的に使用される迅速、容易、かつ低コストの技術を表しています。しかしながら、16S rRNA遺伝子シークエンシングなどの分子生物学技術は、細菌の生存率に関する情報を与えないものの、培養不能な細菌の存在の確認には適用することができる。実際、最近の研究では、母体の卵管微生物叢の一部の細菌が卵白を介して胚に転移し、後に胚腸内細菌集団の大部分を構成するように見えることが示唆された5。さらに、別の研究では、初期胚に収容された微生物植入者の一部は母体の雌鶏から受け継がれており、腸内微生物の豊富さと多様性は後に発生中の環境要因と宿主遺伝学の影響を受けることが示唆された23。しかし、これらの研究の結果はDNA配列解析に基づいており、これらの細菌の多くは卵白(抗菌分子を大量にロード)で死んでいるか複製できない可能性があります。トーマスと共同研究者16 は、BHIプレート上での糞便滴による培養可能な好気性および通性好気性細菌の評価を通じて無菌試験を実施し、無菌無菌制御のための標準的な細菌学的方法の効率を強調した。さらに、提案されたプロトコルでは、非堅固な嫌気性細菌の増殖を検出できるように、レサズリンを用いたチオグリコール酸ブロス中の増殖モニタリングを使用した。
すでに無菌ウズラやニワトリの生産に使用されているこのプロトコルは、ほとんどの営巣鳥からの無菌動物の生産に適応可能であり、これらの動物の生理機能への微生物叢の貢献の研究のための視点を提供します。家禽の腸内の宿主 – 微生物叢の相互相互作用を調査するためにこのモデルを使用することに加えて、それはまた、応用研究のために有用である可能性があります。例えば、動物の健康と堅牢性を改善するために、鶏腸共生微生物に由来するプロバイオティクスの安全性と有効性を評価するために使用することができる。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、受精卵の供給について、ブリーダーと社会Boyé accouvage(La Boissière en Gâtine、フランス)に感謝しています。この研究は、フランスのレジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールが資金提供した研究コンソーシアムAPR-IA “INTEGRITY'(2017-2019)の後援の下で実施されました。
2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
50 mL tubes | Falcon | ||
BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
Pipette aid | Drummond | ||
Plastic pipettes | |||
Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |