Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

Summary

Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Abstract

En enzymologie de fluorescence à molécule unique, la fluorescence de fond à partir de substrats marqués en solution limite souvent la concentration de fluorophores à des plages pico- à nanomolaires, plusieurs ordres de grandeur inférieures à de nombreuses concentrations physiologiques de ligands. Les nanostructures optiques appelées guides d’ondes en mode zéro (ZMW), qui ont des ouvertures de 100−200 nm de diamètre fabriquées dans un métal conducteur mince tel que l’aluminium ou l’or, permettent l’imagerie de molécules individuelles à des concentrations micromolaires de fluorophores en limitant l’excitation de la lumière visible à des volumes efficaces zéptolitres. Cependant, le besoin d’équipements de nanofabrication coûteux et spécialisés a empêché l’utilisation généralisée des ZMW. En règle générale, les nanostructures telles que les ZMW sont obtenues par écriture directe à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons, qui est séquentielle et lente. Ici, colloïdale, ou nanosphère, la lithographie est utilisée comme une stratégie alternative pour créer des masques à l’échelle nanométrique pour la fabrication de guides d’ondes. Ce rapport décrit l’approche en détail, avec des considérations pratiques pour chaque phase. La méthode permet de faire des milliers de ZMW en aluminium ou en or en parallèle, avec des diamètres et des profondeurs de guide d’ondes finaux de 100−200 nm. Seuls l’équipement de laboratoire commun et un évaporateur thermique pour le dépôt de métaux sont requis. En rendant les ZMW plus accessibles à la communauté biochimique, cette méthode peut faciliter l’étude des processus moléculaires aux concentrations et aux taux cellulaires.

Introduction

Les techniques monomoléculaires telles que le transfert d’énergie de résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence à molécule unique (FCS) sont des outils puissants pour la biophysique moléculaire, permettant l’étude des mouvements dynamiques, des conformations et des interactions de biomolécules individuelles dans des processus tels que la transcription^1,2,3,la traduction^4,5,6,et bien d’autres^7. Pour smFRET, la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est une méthode courante car de nombreuses molécules attachées peuvent être suivies au fil du temps, et l’onde évanescente générée par TIR est limitée à une région de 100−200 nm adjacente à la la lamelle de couverture^8. Cependant, même avec cette restriction sur le volume d’excitation, les fluorophores d’intérêt doivent encore être dilués dans des plages pM ou nM afin de détecter des signaux à molécule unique au-dessus de la fluorécence de fond^9. Étant donné que les constantes de Michaelis-Menten des enzymes cellulaires se situent généralement dans la plage μM à mM^10,les réactions biochimiques dans les études à molécule unique sont généralement beaucoup plus lentes que celles dans la cellule. Par exemple, la synthèse des protéines se produit à 15−20 acides aminés par seconde chez E. coli^11,12, tandis que la plupart des ribosomes procaryotes dans les expériences smFRET se traduisent à 0,1−1 acide aminé par seconde¹³. Dans la synthèse des protéines, les structures cristallines et le smFRET sur les ribosomes bloqués ont montré que les ARN de transfert (ARNt) fluctuent entre les états « hybrides » et « classiques » avant l’étape de translocation ARNt-ARNm^14,15. Cependant, lorsque des concentrations physiologiques du facteur GTPase de translocation, EF-G, étaient présentes, une conformation différente, intermédiaire entre les états hybride et classique, a été observée dans smFRET^6. L’étude des processus moléculaires dynamiques à des taux et des concentrations similaires à ceux de la cellule est importante, mais reste un défi technique.

Une stratégie pour augmenter la concentration du substrat fluorescent est l’utilisation d’ouvertures de longueur d’onde sous-visibles à base de métal, appelées guides d’ondes à mode zéro (ZMW), pour générer des champs d’excitation confinés qui excitent sélectivement des biomolécules localisées dans les ouvertures¹⁶ (Figure 1). Les ouvertures sont généralement de 100−200 nm de diamètre et de 100−150 nm de profondeur¹⁷. Au-dessus d’une longueur d’onde de coupure liée à la taille et à la forme des puits (λ_c ≈ 2,3 fois le diamètre pour les guides d’ondes circulaires avec de l’eau comme milieu diélectrique^18),aucun mode de propagation n’est autorisé dans le guide d’ondes, d’où le terme de guides d’ondes en mode zéro. Cependant, un champ électromagnétique oscillant, appelé onde évanescente, en décroissance exponentielle en intensité creuse encore des tunnels à une courte distance dans le guide d’ondes^18,19. Bien que similaires aux ondes évanescentes TIR, les ondes évanescentes ZMW ont une constante de désintégration plus courte, ce qui entraîne une région d’excitation efficace de 10−30 nm dans le guide d’ondes. Aux concentrations micromolaires de ligands marqués par fluorescence, seulement une ou quelques molécules sont simultanément présentes dans la région d’excitation. Cette restriction du volume d’excitation et la réduction conséquente de la fluorescence de fond permettent l’imagerie par fluorescence de molécules uniques à des concentrations biologiquement pertinentes. Ceci a été appliqué à de nombreux systèmes^20,notamment les mesures FCS de diffusion monoprotéique^21,les mesures FRET à molécule unique des interactions ligand-protéine²² à faible affinité et protéine^23,et les mesures spectro-électrochimiques des événements de renouvellement moléculaire unique^24.

Les ZMW ont été produits en modelant directement une couche métallique à l’aide du fraisage par faisceau d’ions^25,26 ou de la lithographie par faisceau d’électrons (EBL) suivie d’une gravure au plasma^16,27. Ces méthodes de lithographie sans masque créent des guides d’ondes en série et nécessitent généralement l’accès à des installations de nanofabrication spécialisées, empêchant l’adoption généralisée de la technologie ZMW. Une autre méthode, la lithographie par nanoimpression ultraviolette^{lift-off 28}, utilise un moule à lame de quartz pour presser un gabarit ZMW inverse sur un film de résistance comme un tampon. Bien que cette méthode soit plus rationalisée, elle nécessite toujours EBL pour la fabrication du moule à quartz. Cet article présente le protocole d’une méthode de fabrication par modèle simple et peu coûteuse qui ne nécessite pas d’EBL ou de fraisage par faisceau d’ions et est basée sur un emballage rapproché de nanosphères pour former un masque lithographique.

La nanosphère ou lithographie « naturelle », qui a été proposée pour la première fois en 1982 par Deckman et Dunsmuir^29,30,utilise l’auto-assemblage de particules colloïdales monodisperses, allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de micromètres^31,pour créer des gabarits de motif de surface via la gravure et / ou le dépôt de matériaux. Les réseaux périodiques étendus bidimensionnels (2D) ou tridimensionnels (3D) de particules colloïdales, appelés cristaux colloïdaux, sont caractérisés par une iridescence brillante de diffusion et de diffraction^32. Bien que moins largement utilisée que le faisceau d’électrons ou la photolithographie, cette méthodologie de masquage est simple, peu coûteuse et facilement réduite pour créer des tailles d’entités inférieures à 100 nm.

Diriger l’auto-assemblage de particules colloïdales détermine le succès de l’utilisation de cristaux colloïdaux comme masques pour le modelage de surface. Si la taille et la forme des particules sont homogènes, les particules colloïdales peuvent être facilement auto-assemblées avec un emballage hexagonal, entraîné par épuisement entropique^33. L’évaporation de l’eau après dépôt est une voie efficace pour sédimenter les particules colloïdales, bien que d’autres méthodes comprennent le trempage-revêtement^34,le spin-coating^35,le dépôt électrophorétique^36,et la consolidation à une interface air-eau^37. Le protocole présenté ci-dessous est basé sur la méthode de sédimentation par évaporation, qui était la plus simple à mettre en œuvre. Les interstices triangulaires entre les billes de polystyrène serrées forment des ouvertures dans lesquelles plaquer un métal sacrificiel, formant des poteaux(figure 2 et figure supplémentaire 1). Un bref recuit des perles avant cette étape ajuste la forme et le diamètre de ces poteaux. Les perles sont enlevées, une dernière couche métallique est déposée autour des poteaux, puis les poteaux sont enlevés. Après les deux étapes de dépôt de métaux sur le nanomasque colloïdal, l’élimination des poteaux intermédiaires et la modification de la chimie de surface pour la passivation et l’attache, les réseaux ZMW sont prêts à être utilisés pour l’imagerie à molécule unique. Une caractérisation plus approfondie des propriétés optiques ZMW après fabrication peut être trouvée dans un article d’accompagnement^38. Outre un évaporateur thermique pour le dépôt en phase vapeur des métaux, aucun outil spécialisé n’est nécessaire.

Protocol

REMARQUE: Toutes les étapes peuvent être effectuées dans l’espace de laboratoire général. 1. Nettoyage des lamaux de couverture en verre Pour fournir une surface propre pour le dépôt par évaporation de particules colloïdales, placez des lamelle de verre borosilicate optique de 24 x 30 mm (épaisseur de 0,16 à 0,19 mm) dans les inserts rainurés d’un bocal de coloration en verre coplin pour le nettoyage.REMARQUE: Assurez-vous que les lamures de couverture sont vertic…

Representative Results

L’auto-assemblage des particules colloïdales de polystyrène par sédimentation par évaporation (étapes 2.1 à 2.13) peut produire une gamme de résultats puisqu’il nécessite un contrôle du taux d’évaporation du solvant. Cependant, comme les dépôts sont rapides (10 à 15 min par tour), la procédure peut être rapidement optimisée pour différentes conditions ambiantes de laboratoire. La figure 3A montre un gabarit colloïdal bien formé après dépôt et évaporation. Macrosc…

Discussion

Pour l’auto-assemblage colloïdal (protocole section 2), l’utilisation d’éthanol plutôt que d’eau comme solvant de suspension accélère le processus d’évaporation de sorte que les gabarits soient prêts en 2−3 min après dépôt plutôt qu’en 1−2 h comme dans les méthodes précédentes^48,49. Le protocole de sédimentation par évaporation présenté ici est également plus simple que les protocoles de sédimentation précédents qui nécessit…

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.