Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Summary

Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.

Abstract

Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.

Introduction

Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti¹e degli epariti². Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico....

Protocol

1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti

1. Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.
2. Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH₂O (800 mg di PFA in 20 mL di dH₂O). Il PFA deve essere preparato per ogni esperimento. Mescolare e riscaldare la soluzione a 55 gradi centigradi per 30 minuti nel cofano. Raffreddare a RT.....

Results

La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in questo s.......

Discussion

Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il loro^{rilevamento 6,20,21,22}. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine prima.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra a 6 pozzetti	TPP	92406	Dimensioni 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Frammento di capra anti-coniglio IgG
anti-tubulina &; gamma;	Sigma-Aldrich	T5192	Coniglio policlonale anti-topo IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (topo)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-topo IgG (molecola intera) F(ab′)2 frammento– Anticorpo Cy3 prodotto negli ovini
Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´ s Aquila modificata&acuto; s medium	Thermo Scientific	11960044	Glicemia alta, Senza glutammina, Gibco
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	D8662	con MgCl2 e CaCl2, filtrato in modo sterile, adatto per colture cellulari
Siero fetale bovino	Thermo Scientific	16000044	filtrato in modo sterile, Gibco
L-Glutammina	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Fibroblasto embrionale di topo
Tubulina monoclonale anti-acetilata	Sigma-Aldrich	T7451	Anticorpo monoclonale anti-tubulina acetilata prodotto in topo
NHLF	Lonza	CC-2512	Fibroblasti polmonari primari (umani)
Siero di capra normale	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127-500G	Polvere
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P0781	10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina per mL in 0,9% NaCl, Shortly-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Fibroblasti cutanei	Gentilmente donato dall'Università Carolina, Facoltà di Medicina di Hradec Krá amorevole.
Slip di copertura quadrati	Thermo Scientific	22X22-1.5	Vetro borosilicato, 22x22mm, Quadrato
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Tripsina-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Filtrato Sterile, Gibco