香烟烟雾对肺 癫痫细胞 伪多多多细胞的影响研究

Summary

这里描述的是一个协议，研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞的细菌殖民化。

Abstract

吸烟是导致肺气肿和慢性阻塞性肺病（COPD）的主要病因。吸烟也会促进呼吸系统细菌感染的易感性。然而，吸烟对人类肺上皮细胞细菌感染的影响尚未得到彻底研究。这里描述的是一个详细的协议，用于准备吸烟提取物（CSE），用CSE治疗人类肺上皮细胞，以及细菌感染和感染测定。CSE 是用传统方法准备的。肺上皮细胞在3小时用4%的CSE治疗，然后，在10的多重感染（MOI）感染伪多Pseudomonas多体。细胞的细菌负荷由三种不同的方法确定。结果表明，CSE增加肺上皮细胞的伪多多体负荷。因此，该协议提供了一种简单且可重复的方法，用于研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响。

Introduction

吸烟影响全世界数百万人的公众健康。许多有害疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺病（COPD），据报与吸烟^有关。,2吸烟会增加呼吸系统3、4、5中^{急性微生物,感染的易感性}。此外，越来越多的证据表明，吸烟可以增强许多慢性疾病^{6、7、8,的,发病机制}。例如，吸烟可能会增加病毒或细菌感染，导致慢性阻塞性肺病^恶化9。在病因上导致慢性阻塞性肺病急性恶化的细菌病原体中，一种机会性克阴性杆菌病原体，伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨，导致感染与不良预知和较高的死亡^{10，11。,11}慢性阻塞性肺病的恶化通过加速病理进展使疾病恶化。除了抗症状管理^12，没有有效的治疗COPD恶化。慢性阻塞性肺病的恶化会加剧病人的死亡率，降低生活质量，增加社会^{的经济负担}。

呼吸道是一个开放的系统，不断受到外部存在的各种微生物病原体的影响。机会性细菌病原体通常在上气道中检测到，但有时在下气道^{14，15,中被发现}。在动物模型中，在感染¹⁶后，只要1小时，就可以在阿尔维拉尔囊中检测到P.aeruginosa。作为一种主要的防御机制，免疫细胞，如巨噬细胞或嗜中性粒细胞，可消除气道中的细菌。肺上皮细胞作为第一个生理屏障，在宿主防御微生物感染方面具有独特的作用。肺上皮细胞可以调节微生物入侵、殖民化或复制，独立于免疫细胞^17。上皮细胞中发现的一些分子，包括PPARg，发挥抗菌功能，从而调节细菌殖民化和复制在肺上皮细胞^18。吸烟可能会改变分子，损害肺上皮细胞的正常防御功能19，20。^19,20最近的研究表明，使用机器人吸烟装置^21，22,将香烟烟雾直接暴露在肺上^皮细胞中。然而，接触烟雾可以通过其他方式进行，包括应用 CSE。CSE 的制备是一种可重复的方法，具有其他细胞类型的潜在应用，包括间接暴露在香烟烟雾中的血管内皮细胞。

本报告描述了一种产生香烟烟雾提取物以改变肺上皮细胞中细菌负荷的协议。CSE增加 P.aeruginosa的细菌负荷，它可能有助于在COPD恶化中通常看到的细菌感染的复发。一种常规方法用于制备 CSE。肺上皮细胞，在他们的指数生长阶段，用4%的CSE治疗3小时。或者，单层培养的肺上皮细胞可以在空气-液体界面中直接暴露在香烟烟雾中。然后，CSE治疗的 细胞在 10的多重感染（MOI）上接受伪多多纳斯的挑战。细菌以特定的摇动速度传播，以确保其旗杆菌的形态保持不变，以保持其全部的侵入能力。根霉素用于杀死培养基中留下的细菌，从而减少细菌负荷的后续测定过程中的潜在污染。该协议还使用GP标签的伪多 monas，这已被作为研究不同模型中 伪多多纳斯 感染的有力工具。一个代表菌株 是P.氟森s 米古拉^23。CSE治疗后感染程度或细菌负荷通过三种方式确定：带菌落计数的滴板方法，使用伪 多多 纳斯16S rRNA特异性底法的定量PCR，或感染荧光伪多多纳斯细胞的流细胞 仪。该协议是研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响的简单且可重复的方法。

Protocol

1. 100% CSE 制备 将 10 mL 的无血清细胞培养基（BEAS-2B 细胞的 DMEM/F12;HSAEC 细胞的气道上皮细胞基质）绘制到 60 mL 注射器中。 反向将适当修剪的 1 mL 移液器尖端连接到注射器的喷嘴中，作为用于容纳香烟 （3R4F） 的适配器。 取出香烟的过滤器。将香烟连接到尖端适配器上，然后点燃香烟。 将 40 mL 含烟空气吸入 10 mL 的无血清介质中。通过剧烈摇晃（每次绘制 30 s）将烟?…

Representative Results

图用于说明图1 中的协议。肺上皮 BEAS-2B细胞用CSE治疗，并挑战伪多莫纳斯。培养基中的伪多多纳斯被添加的根霉素杀死，细胞接受滴板测定、伪多多体16SRNA的RT-qPCR检测和流动细胞切除术。与控制相比，CSE治疗在滴板方法中大大增加了细菌感染（图2）。相应地，CSE在HSAEC中受影响的细菌负荷（图3）。细胞生存?…

Discussion

细菌进入肺上皮细胞是细菌感染发病机制的关键一步。细菌进入细胞的过程可以分为以下三个步骤：第一，细菌接触并附着在上皮细胞表面使用其旗菌。其次，细菌要么进行内化，要么穿透细胞膜。最后，如果细菌成功逃脱细胞防御机制^{25，26，细菌复制和殖民细胞}。观察肺微噬细胞细菌感染的方法早已发展起来，但对肺上皮细胞^{的了解有?…}

Materials

50mL syringe	BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium	ATCC	PCS-300-030
Bacteria shaker	ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit	ATCC	PCS-300-040
Cell Counter	Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT	ThermoFisher Scientific	4387406
HITES medium	ATCC	ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells	ATCC	ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells	ATCC	ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer	BD Biosciences
Nikkon confocal microscope	Nikkon
OD reader	USA Scientific
PCR primers	ITD
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC 47085	PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula	ATCC	ATCC 27853	P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)	University of Kentucky	TP-7-VA
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Transprent PET Transwell Insert	Corning Costar
Tryptic Soy Broth	BD Biosciences