Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares
Summary
Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.
Abstract
El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.
Introduction
El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC9. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático12. La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad13.
Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección16. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias17. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares18. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.
Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula23de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.
Protocol
Representative Results
Discussion
La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
Riferimenti
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
