JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Akciğer Epitel Hücrelerinde Sigara Dumanının Pseudomonas Enfeksiyonu Üzerine Etkilerinin İncelanması

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/61163
, , ,
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Burada açıklanan sigara dumanı ekstresi akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu nasıl etkilediğini incelemek için bir protokoldür.

Abstract

Sigara, akciğer amfizemi ve kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) başlıca etiyolojik nedenidir. Sigara içmek aynı zamanda solunum sistemindeki bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlığı da teşvik eder. Ancak, sigaranın insan akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkileri henüz iyice incelenmemiştir. Burada açıklanan sigara ekstrelerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol (CSE), CSE ile insan akciğer epitel hücrelerinin tedavisi, ve bakteriyel enfeksiyon ve enfeksiyon tayini. CSE geleneksel bir yöntemle hazırlanmıştır. Akciğer epitel hücreleri 3 h. CSE tedavi hücreleri için% 4 CSE ile tedavi edildi, daha sonra, enfeksiyon çokluğu pseudomonas ile enfekte edildi (MOI) 10. Hücrelerin bakteri yükleri üç farklı yöntemle belirlendi. Sonuçlar, CSE’nin akciğer epitel hücrelerinde Pseudomonas yükünü artırdığını gösterdi. Bu protokol, bu nedenle, akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonlar üzerinde sigara dumanı etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Sigara içmek dünya çapında milyonlarca insanın halk sağlığını etkiler. Akciğer kanseri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere birçok zararlı hastalık, sigara ile ilgili olduğu bildirilmiştir1,2. Sigara solunum sisteminde akut mikrobiyal enfeksiyonlara yatkınlığı artırır3,4,5. Ayrıca, montaj kanıtlar sigara birçok kronik bozuklukların patogenezini artırır kanıtlıyor6,7,8. Örneğin, sigara içme KOAH alevlenme neden viral veya bakteriyel enfeksiyonları artırabilir9. Etyolojik KOAH akut alevlenme katkıda bakteriyel patojenler arasında, fırsatçı bir gram-negatif bacillus patojen, Pseudomonas aeruginosa, kötü prognoses ve yüksek mortalite ile ilişkili enfeksiyonlara neden olur10,11. KOAH alevlenmepatolojisi patolojik ilerlemeyi hızlandırarak hastalığı kötüleştirir. Koah alevlenmelerine karşı antisemptomatik tedavi dışında etkili bir tedavi yoktur12. KOAH alevlenmesi hasta ölümlerini teşvik eder, yaşam kalitesini düşürür ve toplum üzerindeki ekonomik yükü artırır13.

Solunum yolu açık bir sistemdir, sürekli olarak çeşitli mikrobiyal patojenlere maruz kalırlar. Fırsatçı bakteriyel patojenler genellikle üst solunum yollarında tespit edilir ancak bazen alt hava yollarında gözlenir14,15. Hayvan modellerinde P. aeruginosa en kısa sürede alveoler keselerde tespit edilebilir 1 saat enfeksiyonsonra 16. Önemli bir savunma mekanizması olarak, makrofajlar veya nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri hava yollarında bakterileri ortadan kaldırır. Akciğer epitel hücreleri, ilk fizyolojik bariyer olarak, mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma benzersiz bir rol oynamaktadır. Akciğer epitel hücreleri mikrobiyal invazyonu, kolonizasyon, ya da bağışıklık hücrelerinden bağımsız çoğaltma düzenleyebilir17. PpARg da dahil olmak üzere epitel hücrelerinde bulunan bazı moleküller, antibakteriyel fonksiyonlar uygulamak, bu nedenle akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu ve replikasyon düzenleyen18. Sigara içme molekülleri değiştirebilir ve akciğer epitel hücrelerinde normal savunma fonksiyonu bozabilir19,20. Son çalışmalar da sigara dumanının akciğer epitel hücrelerine robot sigara aleti kullanarak doğrudan maruz kaldıktan sonra21,22. Dumana maruz kalma, CSE uygulaması da dahil olmak üzere başka şekillerde yapılabilir. CSE hazırlanması dolaylı olarak sigara dumanına maruz kalan vasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinde potansiyel uygulamalar ile tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

Bu rapor akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel yükü değiştirmek için sigara dumanı ekstresi oluşturmak için bir protokol açıklar. CSE P. aeruginosabakteriyel yükünü artırır , ve genellikle KOAH alevlenme görülen bakteriyel enfeksiyonların nüks katkıda bulunabilir. CSE’nin hazırlanmasında geleneksel bir yöntem kullanılmaktadır. Akciğer epitel hücreleri, üstel büyüme aşamasında, 3 saat için% 4 CSE ile tedavi edilir. Alternatif olarak, monolayer kültürlü akciğer epitel hücreleri doğrudan bir hava-sıvı arayüzü sigara dumanı maruz kalınabilir. CSE ile tedavi edilen hücreler daha sonra 10 enfeksiyon (MOI) bir çokluk pseudomonas ile meydan. Bakteriler, kamçılarının morfolojisinin tam invaziv kapasitelerini korumak için bozulmadan kalmasını sağlamak için belirli bir sallayarak yayılır. Gentamisin kültür ortamında kalan bakterileri öldürmek için kullanılır, böylece bakteri yükünün sonraki belirlenmesi sırasında potansiyel kontaminasyon azaltarak. Protokol aynı zamanda GFP etiketli Pseudomonaskullanır , hangi farklı modellerde Pseudomonas enfeksiyon çalışmalarında güçlü bir araç olarak kullanılmıştır. Bir temsilcisi suşu P. fluorescens Migula23olduğunu. CSE tedavisinden sonra enfeksiyon veya bakteriyel yük derecesi üç şekilde belirlenir: koloni sayma ile damla plaka yöntemi, Pseudomonas 16S rRNA özgü astarlar kullanarak kantitatif PCR, veya floresan Pseudomonasile enfekte hücrelerde akış sitometri . Bu protokol, sigara dumanının akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

Protocol

1. 0 CSE hazırlığı 10 mL serumsuz hücre kültürü ortamını (BEAS-2B hücreleri için DMEM/F12; HSAEC hücreleri için hava yolu epitel hücre bazal orta) 60 mL şırıngaya çekin. Sigarayı (3R4F) tutmak için adaptör olarak şırınganın nojesine uygun şekilde kesilmiş 1 mL pipet ucu takın. Sigaranın filtresini çıkarın. Uç adaptörüne bir sigara takın ve sigarayı yakın. 10 mL serumsuz ortama 40 mL duman içeren hava çekin. Şiddetle sallayarak orta ile d…

Representative Results

Şekil 1’dekiprotokolü göstermek için bir diyagram kullanılır. Akciğer epitelyal BEAS-2B hücreleri CSE ile tedavi edildi ve Pseudomonasile meydan okudu. Kültür ortamındaki pseudomonas ilave gentamisin tarafından öldürüldü ve hücreler damla plaka sınaması, Pseudomonas ribozom 16S RNA RT-qPCR tespiti ve akış sitometrisine tabi tutuldu. Kontrol ile karşılaştırıldığında, CSE tedavisi damla plaka yöntemlerinde bakteriyel enfeksiyonu önemli …

Discussion

Akciğer epitel hücrelerine bakteriyel invazyon bakteriyel enfeksiyonların patogenezinde önemli bir adımdır. Hücrelere bakteri istilası süreci aşağıdaki üç adıma ayrılabilir: Birincisi, bakteriler temas ve onların kamçı kullanarak epitel hücre yüzeyine yapışır. İkinci olarak, bakteriler ya içselleştirme den geçer ya da hücre zarına nüfuz eder. Son olarak, bakteriler çoğalTabilir ve başarılı hücresel savunma mekanizmaları kaçarsanız hücreleri kolonize25,…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Tarafından desteklenmiştir R01 HL125435 ve HL142997 (CZ) hibe.

Materials

50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Tags

Cigarette SmokePseudomonasLung Epithelial CellsBacterial LoadCell CultureSmoke ExtractionBacterial InfectionCell CountingCell SuspensionCell Preparation
check_url/it/61163?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image