यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश लार्वा में एस्परगिलस संक्रमण मॉडल का वर्णन करता है। एस्परगिलस बीजाणु लार्वा के हिंडब्रेन में माइक्रोइंजेक्टेड होते हैं, और इम्यूनोसप्रेसेशन को प्रेरित करने के लिए रासायनिक उपचार का उपयोग किया जाता है। संक्रमण प्रगति की निगरानी एक दैनिक इमेजिंग सेटअप के माध्यम से की जाती है ताकि फंगल विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ कॉलोनी बनाने इकाई चढ़ाना द्वारा लाइव बीजाणुओं की गणना की निगरानी की जा सके।
इनवेसिव एस्परगिलोसिस (आईए) इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों के बीच सबसे आम फंगल संक्रमणों में से एक है। एंटीफंगल दवाओं की उपलब्धता के बावजूद, आईए संक्रमित इम्यूनोसमझौता रोगियों में >५०% मृत्यु का कारण बन सकता है । यह दोनों मेजबान और रोगजनक कारकों है कि संक्रमण संवेदनशीलता और संक्रमित रोगियों में कम जीवित रहने की दर में योगदान के लिए उपंयास चिकित्सा विकसित करने के लिए निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं एस्परगिलस बीजाणुओं की मान्यता और निकासी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, हालांकि सटीक सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है। मेजबान और रोगजनक के बीच विस्तृत मशीनी बातचीत की जांच करने के लिए विश्वसनीय मॉडल की आवश्यकता होती है। जेब्राफिश लार्वा की ऑप्टिकल स्पष्टता और आनुवंशिक अनुरेखा उन्हें एक जीवित और बरकरार मेजबान में कई मानव जीवाणु और फंगल संक्रमणों के मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक पेचीदा मॉडल बनाती है। यह प्रोटोकॉल एक लार्वा जेब्राफिश एस्परगिलस संक्रमण मॉडल का वर्णन करता है। सबसे पहले, एस्परगिलस बीजाणुओं को अलग-थलग कर दिया जाता है और माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से जेब्राफिश हिंडब्रेन वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है। फिर, इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं जैसे रासायनिक अवरोधकों को सीधे लार्वा पानी में जोड़ा जाता है। इंजेक्शन लार्वा में संक्रमण की निगरानी के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें कॉलोनी बनाने इकाई (सीएलयू) गणना के लिए लार्वा का 1) समरूपीकरण और 2) एक दोहराया, दैनिक लाइव इमेजिंग सेटअप शामिल है। कुल मिलाकर, इन तकनीकों का उपयोग वीवो में एस्परगिलस संक्रमण की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और मेजबान-रोगजनक बातचीत से पूछताछ करने के लिए विभिन्न मेजबान पृष्ठभूमि और एस्परगिलस उपभेदों पर लागू किया जा सकता है।
एस्परगिलस फ्यूमिगटस एक सर्वव्यापी सैप्रोफाइटिक कवक है, और इसके हवाई बीजाणु घर के अंदर और बाहरदोनों 1पाए जा सकते हैं। ये बीजाणु हर किसी के साँस लेते हैं लेकिन इम्यूनोसंटिव व्यक्तियों के फेफड़ों से प्रभावी रूप से साफ हो जाते हैं1,2. हालांकि, सिस्टिक फाइब्रोसिस जैसे परिवर्तित फेफड़ों की स्थिति वाले लोग फेफड़ों में फंगल अंकुरण के कारण ब्रोन्कोपल्मोनरी एस्परगिलोसिस विकसित कर सकते हैं3। इस संक्रमण का सबसे गंभीर रूप, आक्रामक एस्परगिलोसिस (आईए), इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों को प्रभावित करता है और इसमें कवक का अन्य अंगों में विकास शामिल है2,3। आईए एंटी-फंगल उपचार 4 की उपलब्धता के बावजूद संक्रमित रोगियों की>५०%मौत की ओर जाता है । इम्यूनोसंटिव व्यक्तियों में, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं साँस वाले बीजाणुओं को साफ करने में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं1। हालांकि, विशिष्ट तंत्र है कि इस सहज प्रतिरक्षा निकासी में योगदान अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । आईए के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए एस्परगिलस की मंजूरी में प्रमुख जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल) के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है।
जबकि स्तनधारी मॉडल फंगल उग्रता कारकों की पहचान करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं5,6की मेजबानी करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, दृश्य पहुंच सेलुलर स्तर पर मेजबान रोगजनक बातचीत के लिए सीमित है। ऊतक संस्कृति प्रयोग जटिल बहु-सेलुलर वातावरण और पूरे जानवरों में मौजूद बातचीत को पूरीतरहसे पुनः रीजिट नहीं कर सकते हैं। इसलिए, ज़ेब्राफ़िश ने इस अंतर को भरने के लिए एक वैकल्पिक मॉडल जीव के रूप में लोकप्रियता प्राप्त की है और एक बहु-दिवसीय संक्रमण8,9में एक जीवित, अक्षुण्ण मेजबान में मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन के अध्ययन को सुविधाजनक बना दिया है। जेब्राफिश जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 24 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ)10के रूप में विकसित होती है, और अनुकूली प्रणाली को11विकसित करने में 4-6 सप्ताह लगते हैं, जो समय की एक खिड़की प्रदान करते हैं जिसमें सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को अलगाव में मूल्यांकन किया जा सकता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं मनुष्यों और जेब्राफिश11के बीच अच्छी तरह से संरक्षित हैं। ज़ेब्राफ़िश में कई गुण होते हैं जो इन प्रतिक्रियाओं की जांच को सुविधाजनक बनाते हैं, जिनमें ऑप्टिकल स्पष्टता (जो अक्षुण्ण मेजबानों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देता है) और आनुवंशिक अनुरेखण (जो आणविक मशीनवादी अध्ययनों की सुविधा प्रदान करता है)।
यहां वर्णित लार्वा जेब्राफिश एस्परगिलस संक्रमण मॉडल मूल रूप से नॉक्स एट अलद्वाराविकसित किया गया था। हाल ही में हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा12 , 13, मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन13,14, 15,इम्यूनोसप्रेसेशन के तंत्र 13,16,17,फंगल उग्रता18और एंटी-फंगल ड्रग प्रभावकारिता19,20की जांच करने के लिए इसका विस्तार किया गया है । यह मॉडल मानव एस्परगिलोसिस के कई पहलुओं को पुनः रीकैपिटल करता है। जबकि इम्यूनोसंपेस्टेंट लार्वा प्रतिरोधी होते हैं, इम्यूनोसमझौता लार्वासंक्रमण 12, 13,16,17का शिकार हो सकता है।
इस मॉडल में, लार्वा के हिंडब्रेन वेंट्रिकल में बीजाणुओं को इंजेक्ट करके एक स्थानीय संक्रमण स्थापित किया जाता है, जो फागोसाइट्स के साथ कम आबादी वाला क्षेत्र है, और फागोसिटर भर्ती और व्यवहार का मूल्यांकन12,13किया जा सकता है। ऐसा माना जाता है कि मैक्रोफेज मनुष्यों में एस्परगिलस बीजाणुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करते हैं1 और स्तनधारी मॉडल6,21। इसी तरह, जेब्राफिश मॉडल में, मैक्रोफेज को इंजेक्शन एस्परगिलस बीजाणुओं में भर्ती किया जाता है, जबकि डेंगूफिल को हाइफाल विकास12, 13, 22के जवाब में माध्यमिक रूप से भर्ती कियाजाताहै। इस मॉडल से, यह भी सीखा गया है कि एस्परगिलस संक्रमण के 7 दिनों से अधिक समय के बाद वाइल्डटाइप इम्यूनोसप्यूटेंट लार्वा में बने रह सकते हैं। इसके अलावा, संक्रमण के पूरे पाठ्यक्रम को दैनिक कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा एक ही जीवित जानवरों में पालन किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल निषेचन (2 डीपीएफ) लार्वा के 2 दिनों के हिंडब्रेन वेंट्रिकल में बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक का वर्णन करता है। इसके बाद संक्रमण की निगरानी 7 दिनों तक की जाती है, क्योंकि जेब्राफिश लार्वा बिना खिलाए 10 डीपीएफ तक रह सकता है। इम्यूनोसप्रेसेशन को दवा उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, और लार्वा के लिए दवाओं के आवेदन का भी वर्णन किया गया है। अंत में, संक्रमण प्रगति का पालन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें व्यक्तिगत लार्वा से सीएफयू का मात्राकरण और दैनिक लाइव इमेजिंग सेटअप शामिल है।
यहां वर्णित संक्रमण मॉडल मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, मेजबान-रोगजनक बातचीत, और फंगलरोगजनक12, 13,14,15का विश्लेषण करनेकेलिए फायदेमंद है। यह जानकारी फ्लोरोसेंट-लेबल वाले रोगजनकों और मेजबान कोशिकाओं13,लार्वा अस्तित्व और समय के साथ सीएलयू दृढ़ता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से ली जा सकती है।
माइक्रोइंजेक्शन तकनीक इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न माइक्रोइंजेक्शन उपकरण और सेटअप का उपयोग करते समय समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। विशेष रूप से, इंजेक्शन का दबाव और समय दो प्रमुख चर हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि सुई द्वारा बाहर निकाली गई मात्रा ~ 3 एनएल है। सुई का आकार जैसा कि इसे संदंश के साथ कतरन द्वारा निर्धारित किया जाता है, इंजेक्शन दिए जा रहे बीजाणुओं की संख्या को भी नियंत्रित करता है; हालांकि, एक बड़ा उद्घाटन लार्वा को ऊतक क्षति पहुंचा सकता है। दूसरी ओर, एक खोलने के बहुत छोटे अपेक्षाकृत बड़े बीजाणुओं (>2 माइक्रोन) को बाहर करने की अनुमति नहीं देंगे और सुई क्लोजिंग का कारण बन सकते हैं। यदि ऐसा होता है, सुई को थोड़ा बड़ा खोलने के लिए पीछे हटना जा सकता है।
बैक्टीरिया के माइक्रोइंजेक्शन के लिए अन्य प्रोटोकॉल पीवीपी-40 का उपयोग करते हैं ताकि एक समरूप इंजेक्शन मिश्रण को बनाए रखने में मदद मिल सके, लेकिन हमें एस्परगिलस बीजाणुओं के साथ इस वाहक का उपयोग करने में कोई लाभ नहीं मिला है। सुई के क्लोजिंग को सुई लोड करने से पहले किसी भी झुरमुट को तोड़ने के लिए फंगल तैयारी को अच्छी तरह से भंवर से कम किया जा सकता है। कभी-कभी, सुई में एक रोकना भी अस्थायी रूप से दबाव या इंजेक्शन समय को बढ़ाकर और माइक्रोइंजेक्टर को ट्रिगर करके उखाड़ फेंका जा सकता है जबकि सुई लार्वा के आसपास के तरल में होती है। दबाव और इंजेक्शन समय तो पिछले स्तर ों को फिर से कम किया जाना चाहिए । अन्य मामलों में, एक क्लॉग को हटाया नहीं जा सकता है, और एक नई सुई को लोड और रीकैलिब्रेटेड करने की आवश्यकता होती है।
यह प्रोटोकॉल प्रति लार्वा ~ 30-70 बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह ज्ञात है कि बीजाणु तैयार करने और मात्रा इंजेक्शन की एकाग्रता के आधार पर, यह संख्या काफी कम है। हालांकि, यह अनुभवजन्य रूप से पाया गया है कि यह इन परिस्थितियों में इंजेक्शन दिए गए बीजाणुओं की संख्या है। यह अंतर क्यों होता है अज्ञात है, लेकिन यह सुई में बीजाणु क्लंपिंग के कारण हो सकता है। बड़ी संख्या में बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के हमारे अपने प्रयास काफी हद तक असफल रहे हैं ।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि लगभग 30-70 बीजाणु इंजेक्शन लगाए जा रहे हैं और सभी लार्वा में इंजेक्शन की स्थिरता बनाए रखते हैं, लार्वा के आसपास के E3 पर इंजेक्शन लगाकर बीजाणुओं की संख्या की जांच करें। सभी इंजेक्शन भर में हर पांच से छह लार्वा इसे दोहराएं। यदि बीजाणु गिनती बदलने लगता है, दबाव और/या इंजेक्शन समय कई लार्वा भर में बीजाणुओं की एक सुसंगत संख्या सुई करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, ध्यान रखा जाना चाहिए कि इंजेक्शन की खुराक मुख्य रूप से हिंडब्रेन में रहती है और मिडब्रेन और पूर्वाभास को नहीं भरती है।
एक स्थानीय संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, बीजाणु निलंबन हिंडब्रेन वेंट्रिकल के भीतर समाहित किया जाना चाहिए। यह इंजेक्शन के ठीक बाद फिनॉल लाल धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है, हालांकि लाल रंग समय के साथ फैलता है। इंजेक्शन के लिए,ोट वेसिकल के आसपास के क्षेत्र का उपयोग 45 डिग्री-65 डिग्री कोण पर वेंट्रिकल तक पहुंचने और पहुंचने के लिए किया जाता है। इस क्षेत्र में कोई मुख्य रक्त वाहिकाएं नहीं हैं, कम ऊतक क्षति का कारण बनता है, और तुरंत भर देता है। यदि वेंट्रिकल पर त्वचा छेदा जाता है, तो बीजाणु निलंबन को लीक किया जा सकता है, क्योंकि एस्परगिलस बीजाणु इंजेक्शन के लिए जिस सुई का उपयोग किया जाना चाहिए वह बैक्टीरियल निलंबन के लिए उपयोग की जाने वाली तुलना में बड़ा है। असफल इंजेक्शन या गलती से क्षतिग्रस्त लार्वा को लाल निशान बनाने के लिए या सुई के साथ पंक्ति से बाहर लार्वा को खींचकर एक-दो बार जर्दी में इंजेक्शन देकर चिह्नित किया जा सकता है। इंजेक्शन का एक सेट पूरा होने के बाद, इन लार्वा को हटा दिया जाना चाहिए और बाकी प्लेट से धोए जाने से पहले निपटाया जाना चाहिए। मेथिलीन नीले रंग के बिना E3 का उपयोग इंजेक्शन से पहले लार्वा को एनेस्थेटाइज करने और इंजेक्शन के बाद लार्वा रखने के लिए किया जाता है, क्योंकि मेथिलीन नीला एंटी-फंगल है।
इंजेक्शन के समय, सीएलयू गिनती संक्रमित मेजबान के भीतर व्यवहार्य बीजाणुओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, यदि बीजाणु हाइफाई में अंकुरित होते हैं, तो इन्हें समरूपता के दौरान अलग व्यवहार्य “फंगल इकाइयों” में तोड़ा जा सकता है और कई उपनिवेशों को जन्म दे सकता है। या, एक अटूट बहुकोशिकीय हाइफा एक ही कॉलोनी को जन्म दे सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक औसत, लेकिन गलत, फंगल बोझ का प्रतिनिधित्व होता है। इसे व्यक्तिगत लार्वा के देशांतर माइक्रोस्कोपी के साथ सीआईएफयू की गिनती के संयोजन से कम किया जा सकता है, जो इंजेक्शन बीजाणुओं के भाग्य का दृश्य डेटा प्रदान करता है।
स्तनधारी प्रणाली की तुलना में, जेब्राफिश लार्वा संक्रमण मॉडल अपनी ऑप्टिकल पहुंच के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और प्रतिक्रिया को लाइव अक्षुण्ण मेजबान के भीतर कल्पना की जा सकती है। यह आणविक लक्ष्यों के आनुवंशिक या रासायनिक अवरोध के साथ शामिल किया जा सकता है विश्लेषण करने के लिए कैसे प्रत्येक लक्ष्य एक जीवित जानवर में Aspergillus बीजाणुओं के खिलाफ मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है ।
जबकि जेब्राफिश लार्वा एस्परगिलस संक्रमण मॉडल आईए12, 13, 14,15, 16,17,18,19,20,22के विभिन्न पहलुओं का वर्णन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहता है, विस्तार के अन्य क्षेत्र हैं। मेजबान पक्ष से, इसका उपयोग सेलुलर स्तर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया जाता है, लेकिन इसे लक्षित रूपोलिनो, CRISPR, स्थिर उत्परिवर्ती लाइनों, या रासायनिक जोखिम के साथ जोड़कर आणविक स्तर पर प्रतिरक्षा तंत्र का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। एक चेतावनी यह है कि सभी ज्ञात स्तनधारी जन्मजात प्रतिरक्षा मार्ग घटकों के लिए होमोलॉग की पहचान जेब्राफिश में नहीं की गई है।
रोगजनक पक्ष से विभिन्न प्रजातियों और उपभेदों की उग्रता का वर्णन किया गया है । भविष्य के अनुसंधान का एक आशाजनक अवसर उत्परिवर्ती एस्परगिलस उपभेदों का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए है कि विशिष्ट जीन या प्रोटीन उग्रता कारकों के रूप में कैसे योगदान देते हैं। जिससे इन प्रोटीनों को निशाना बनाने के लिए उपन्यास एंटी फंगल दवाएं विकसित की जा सकती हैं। वर्तमान एंटी-फंगल दवाओं में मानव रोगियों में प्रभावकारिता कम होती है और कवक28में इन दवाओं के प्रति प्रतिरोध बढ़ रहा है । वीवो मॉडल में इसका उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि ये दवाएं विफल क्यों होती हैं और उपन्यास एंटी-फंगल दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक मध्यवर्ती मॉडल के रूप में। कुल मिलाकर, इस मॉडल का उपयोग करके खोजे गए निष्कर्ष एस्परगिलस-संक्रमितरोगियों के लिए प्रभावी उपचार के भविष्य के विकास को सुविधाजनक बना सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या K22AI134677 के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |