JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/61166
, , , , ,
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine,Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine,Dartmouth College

Summary

تقدم هذه الورقة بروتوكولين محسنين لفحص الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط داخل الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والسحايا. يساعد كل من هذه البروتوكولات على التأكد من وظيفة وتكوين الخلايا التي تشغل هذه المقصورات في ظل حالة مستقرة وظروف التهابية.

Abstract

يتكون الجهاز العصبي المركزي (CNS) من الدماغ والحبل الشوكي وتحيط به السحايا ، وهي طبقات غشائية تعمل كحاجز بين المحيط والجهاز العصبي المركزي. الجهاز العصبي المركزي هو موقع متخصص في المناعة ، وفي ظروف الحالة المستقرة ، يكون الامتياز المناعي أكثر وضوحا في حمة الجهاز العصبي المركزي. في المقابل ، تؤوي السحايا مجموعة متنوعة من الخلايا المقيمة ، بما في ذلك الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. أثناء الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو المناعة الذاتية ، أو العدوى ، أو حتى التنكس العصبي ، قد تدخل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتستقر داخل السحايا. يعتقد أن هذه الخلايا تؤدي إجراءات مفيدة وضارة أثناء التسبب في مرض الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من هذه المعرفة ، غالبا ما يتم تجاهل السحايا عند تحليل حجرة الجهاز العصبي المركزي ، لأن طرق استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي التقليدية تحذف الطبقات السحائية. يقدم هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للعزل السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي للفئران (أي الدماغ والحبل الشوكي والسحايا) المناسبة للتحليل النهائي عبر تقنيات الخلية الواحدة والكيمياء الهيستولوجية المناعية وطرق التهجين في الموقع. توفر الطرق الموصوفة تحليلا شاملا لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، وهي مثالية لتقييم النمط الظاهري والوظيفة وتوطين الخلايا التي تشغل حجرة الجهاز العصبي المركزي في ظل ظروف الاستتباب وأثناء التسبب في المرض.

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو موقع متخصص في المناعة. يعتبر النسيج البرنشيمي للجهاز العصبي المركزي ، باستثناء مساحة السائل الدماغي الشوكي والسحايا والأوعية الدموية ، تقليديا على أنه موقع متميز مناعيا1،2،3،4،5 وهو خال نسبيا من الخلايا المناعية خلال ظروف الاستتباب 2،6،7. في المقابل ، فإن السحايا ، التي تتكون من طبقات الجافية والعنكبوتية والحنون ، هي مكونات حاسمة في حجرة الجهاز العصبي المركزي ، وتشارك بنشاط في المراقبة المناعية التماثلية والعمليات الالتهابية أثناء التسبب في المرض3،6،7،8. خلال ظروف الحالة المستقرة ، تدعم السحايا العديد من الخلايا الخافرة المناعية ، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) ، والبلاعم ، والخلايا المتغصنة (DC) ، والخلايا البدينة ، والخلايا التائية ، وبدرجة أقل ، الخلايا البائية9،10،11.

السحايا عبارة عن هياكل شديدة الأوعية الدموية وتحتوي على أوعية لمفاوية توفر اتصالا لمفائيا بين الجهاز العصبي المركزي ومحيطه8،12،13،14. في الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو الالتهابات ، أو المناعة الذاتية ، أو حتى التنكس العصبي ، تتسلل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتغير المشهد المناعي داخل السحايا. بعد تسلل الخلايا ، قد تمثل السحايا مكانا وظيفيا للخلايا المناعية المشتقة من المحيط ، مما يعزز تراكم الخلايا المناعية ، وتنشيط الخلايا المناعية المحلية ، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في حجرة الجهاز العصبي المركزي. لوحظ التهاب سحائي بارز في أمراض متعددة تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS) 15،16،17،18،19 ، السكتة الدماغية 20،21 ، إصابة معقمة 22،23 (أي إصابة الحبل الشوكي وإصابات الدماغ الرضحية) ، الصداع النصفي 24 ، والعدوى الميكروبية 25،26 ،27,28,29. وبالتالي ، فإن توصيف الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة محيطيا في المقصورة السحائية أمر ضروري لفهم دور هذه الخلايا أثناء ظروف الحالة المستقرة والتسبب في المرض.

يعد استخراج الدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الجمجمة والأجسام الفقرية أمرا صعبا من الناحية الفنية ويستغرق وقتا طويلا. لا توجد حاليا تقنيات متاحة للاستخراج السريع للدماغ مع سلامة جميع طبقات السحايا الثلاث. في حين أن استئصال الصفيحة الفقرية ينتج مورفولوجيا ممتازة لأنسجة الحبل الشوكي ويحافظ على الطبقات السحائية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا للغاية ومعقدا30,31. على العكس من ذلك ، فإن طرق الاستخراج التقليدية مثل إزالة الدماغ من الجمجمة والبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي تسهل الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، ولكن يتم فقدان كل من السحايا العنكبوتية والجافية بهذه التقنيات30,31. يؤدي إغفال طبقات الجافية والعنكبوتية أثناء العزل التقليدي لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي إلى تحليل غير مكتمل للخلايا داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن تحديد التقنيات الجديدة التي تركز على الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي مع السحايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الأمثل لحجرة الجهاز العصبي المركزي.

تقدم هذه المخطوطة طريقتين للاستخراج السريع للدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الفئران، مما يسهل التحليل النهائي للخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة من الأطراف في حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا. تركز هذه البروتوكولات المحسنة على 1) عزل معلقات الخلية الواحدة للتحليل النهائي و 2) تحضير الأنسجة للمعالجة النسيجية. يسمح الحصول على معلقات أحادية الخلية من الدماغ وأنسجة الحبل الشوكي والسحايا الجافية والعنكبوتية32 بالتحليل المتزامن للخلايا الموجودة في كل من المقصورات المتنية والسحائية. يمكن استخدام معلقات الخلية الواحدة في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك مقايسات زراعة الخلايا لأداء التحفيز في المختبر 33 ، والبقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot) 28،34،35 ، وقياس التدفق الخلوي36،33 ، والخلية الواحدة 37 أو النسخ السائب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول الأمثل لإزالة الكلس من الأدمغة الكاملة والحبل الشوكي مع الجماجم السليمة أو الأعمدة الفقرية ، على التوالي ، يسمح بإزالة الكلس بلطف من العظام المحيطة ، وترك السحايا سليمة والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تسمح هذه الطريقة بالتحديد الانتقائي للبروتينات أو الحمض النووي الريبي باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) أو تقنيات التهجين في الموقع (ISH) داخل كل من المساحات المتنية والسحائية. قد يوفر توصيف النمط الظاهري وحالة التنشيط وتوطين الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة طرفيا داخل الجهاز العصبي المركزي معلومات أساسية لفهم كيفية مساهمة أنواع الخلايا الفردية في حجرة الجهاز العصبي المركزي في الاتزان الداخلي والتسبب في المرض.

Protocol

تستخدم جميع الأعمال الحيوانية البروتوكولات التي تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في كلية جيزل للطب في دارتموث. 1. معالجة عينات الدماغ والحبل الشوكي لإزالة الكلس عزل عينات الدماغ والحبل الشوكي القتل الرحيم…

Representative Results

هدفت هذه التجربة التمثيلية إلى تحديد كمية الخلايا البائية والتائية ووصف توطين الخلايا البائية والتائية في مقصورات الجهاز العصبي المركزي السحائية والمتني في ظروف الاستتباب وكذلك في نموذج MS التدريجي للفئران (أي TMEV-IDD). تم تحفيز TMEV-IDD في إناث الفئران SJL البالغة من العمر 5 أسابيع عن طريق العدوى…

Discussion

تعد طرق تقييم التركيب الخلوي في حجرة الجهاز العصبي المركزي أثناء التوازن والمرض ضرورية لفهم الحالات الفسيولوجية والمرضية للجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، على الرغم من أنها تعمل كحاجز مهم في الجهاز العصبي المركزي وتضم مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية ، غالبا ما يتم حذف السحايا من التحلي?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون موظفي مركز الطب المقارن والبحوث (CCMR) في دارتموث على رعايتهم الخبيرة للفئران المستخدمة في هذه الدراسات. قام صندوق بورنشتاين للأبحاث بتمويل هذا البحث.

Materials

Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Ricerca sul cancro. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler’s Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

MeningesImmune CellsSingle Cell AnalysisHistological MethodsMicrogliaAstrocytesPericytesEndothelial CellsStromal CellsNeuronsBrainSpinal CordDecalcificationSkull CapVertebrae Column
check_url/it/61166?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image