人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离

Summary

呈现是将人类和动物心室心肌细胞与振动切切心肌切片分离的协议。耐钙细胞（高达200个细胞/毫克）的高产量可以从少量组织（<50毫克）中获得。该协议适用于暴露于冷缺血的心肌，长达36小时。

Abstract

将心室心肌细胞与动物和人类心脏分离是心脏研究的基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注与消化酶分离。然而，分离人类心肌细胞是具有挑战性的，因为人类心肌标本通常不允许冠状动脉灌注，而替代的分离方案导致活细胞产量低。此外，人类心肌标本是罕见的，只有定期在机构与现场心脏手术。这妨碍了从动物到人类心肌细胞的发现翻译。这里描述的是一个可靠的协议，能够有效地分离心室菌体与人类和动物的心肌。为了增加表面体积比，同时尽量减少细胞损伤，心肌组织切片300 μm厚由具有振动器的心肌标本生成。然后用蛋白酶和胶原酶消化组织切片。鼠菌通过流动细胞测量细胞计数建立协议并量化可行、耐钙的菌细胞的产量。与常用组织块法的比较显示，棒状心肌细胞的产量显著提高（41.5 ± 11.9 与 7.89 = 3.6%，p < 0.05）。该协议被转化为失败和非失败的人类心肌，其产量与大鼠心肌相似，同样明显高于组织块法（45.0 × 15.0 vs. 6.87 = 5.23细胞/毫克，p < 0.05）。值得注意的是，通过提出的协议，有可能从少量组织（<50毫克）中分离出合理数量的可行人类心肌细胞（9~200个细胞/毫克）。因此，该方法适用于来自人类和动物心脏的健康和失败的心肌。此外，在冷心肺溶液中，从储存长达36小时、长达36小时人体组织标本中分离出兴奋和收缩的菌细胞，使该方法对于无需现场心脏手术的机构实验室特别有用。

Introduction

一项开创性技术，为心肌细胞生理学的重要见解铺平了道路，是将活的心室心肌细胞与完整的心脏^1隔离。分离的心肌细胞可用于研究正常的细胞结构和功能，或体内实验的后果;例如，评估心脏疾病动物模型中细胞电生理学或激发-收缩耦合的变化。此外，分离的心肌细胞可用于细胞培养、药理干预、基因转移、组织工程和许多其他应用。因此，有效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本价值。

来自小型哺乳动物（如啮齿动物）和大型哺乳动物（如猪或狗）的心肌细胞通常通过心脏的冠状动脉灌注与含有粗胶原蛋白酶和/或蛋白酶的溶液分离。这被描述为心肌细胞分离的”黄金标准”方法，导致高达70%的活细胞^2。这种方法也用于人类心脏，导致^,可接受的心肌细胞产生^{3，4，5。,45}然而，由于冠状动脉灌注只有在有完整的心脏或含有冠状动脉分支的大心肌楔子可用的情况下才可行，因此大多数人类心脏标本不适合这种方法，因为它们体积小，缺乏适当的血管。因此，人类心肌细胞的分离是具有挑战性的。

人类心肌标本主要由大小可变的组织块（约0.5 x 0.5 x 0.5厘米至2×2×2厘米）组成，通过内氧心肌活检^获得6，隔膜^{心肌切除术7，VAD植入8，}或从外植心脏^9。心肌细胞分离最常见的程序从用剪刀或手术刀切碎组织开始。然后，细胞到细胞的接触被浸入无钙或低钙缓冲液中破坏。随后是多个消化步骤与粗酶提取物或纯化酶，如蛋白酶（如蛋白酶），胶原酶，红霉素酶，或弹性酶，导致细胞外基质的解体和心肌细胞的解放。在最后的关键步骤中，生理钙浓度必须仔细恢复，否则细胞损伤可能发生由于钙悖论^{10，11，12。,11,12}这种隔离方法很方便，但通常效率低下。例如，一项研究发现，需要近1克心肌组织才能获得足够数量的心肌细胞，适合随后的实验^13。产量低的一个可能原因是比较苛刻的切碎组织的方法。这可能特别损害位于块边缘的心肌细胞，尽管这些肌细胞最有可能通过酶消化释放。

可能影响从人体标本获得的细胞的分离效率和质量的另一个方面是组织缺血的持续时间。大多数协议都提到实验室的运输时间短是取得良好结果的先决条件。这限制了人类心室心肌细胞的研究，而实验室有附近的心脏手术设施。总之，这些限制妨碍了人类心肌细胞动物模型的重要发现验证。因此，改进的分离方案，允许从少量组织中产生高心肌细胞，最好在延长运输时间后不会造成严重伤害。

这里描述的是一个隔离协议，基于酶消化的薄心肌组织切片产生的振动体^{14，15。14,}我们证明，与用剪刀切碎的组织块分离组织切片的效率要高得多。所述方法不仅允许从少量心肌组织中高产量的活人心肌细胞，而且适用于在冷心肺溶液中储存或运输的标本，时间长达36小时。

Protocol

所有大鼠实验都得到德国巴伐利亚州米特尔弗兰肯动物护理和使用委员会的批准。埃尔兰根-纽伦堡大学和鲁尔-波鸿大学机构审查委员会批准了人体心脏组织样本的收集和使用。根据《赫尔辛基宣言》准则进行了研究。患者在组织采集前给予书面知情同意。 雌性威斯塔大鼠（150–200克）通过注射100毫克/千克的硫化钠进行麻醉，通过宫颈脱位安乐死，然后进行胸腔切除术和心?…

Representative Results

为了验证分离效率，该协议与大鼠心肌并一起使用，结果可行的菌细胞数量与通过冠状动脉灌注和从小组织块分离获得的数量进行比较（块分离， 图2).块分离和分离组织切片从相同的心脏执行。然而，对于通过冠状动脉灌注的隔离，使用了整个心脏。冠状灌注主要产生棒状和交叉条纹心肌细胞。与心肌切片分离，观察到的棒状细胞比例较低，但总数仍然很高。相比之下，从…

Discussion

虽然活体心肌细胞的分离是在40多年前建立的，并且仍然是许多心脏研究实验方法的先决条件，但它仍然是一个难以预测的结果的技术。心肌细胞通过输注冠状动脉与酶溶液进行分离，通常用于小动物的心脏，并产生大量可行的细胞。然而，这需要一个相对复杂的系统和专门知识。此外，由于人体组织样本体积小或没有冠状动脉分支，因此不适合使用这种方法，这使得人类心肌细胞分离的新方法?…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection