בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

Summary

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ”ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (<50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

Abstract

הבידוד של מיוציטים לבביים חדריים מלב בעלי חיים ולבבות אנושיים היא שיטה בסיסית במחקר לב. קרדיומיוציטים בעלי חיים מבודדים בדרך כלל על ידי עירוי כלילית עם אנזימי עיכול. עם זאת, בידוד cardiomyocytes אנושי הוא מאתגר כי דגימות שריר הלב האנושי בדרך כלל אינם מאפשרים זינגה כלילית, פרוטוקולי בידוד חלופי לגרום לתשואות נמוכות של תאים קיימא. בנוסף, דגימות שריר הלב האנושי הן נדירות ותו זמינות רק באופן קבוע במוסדות עם ניתוח לב באתר. זה פוגע בתרגום של ממצאים מהחיות לקרדיומיוציטים אנושיים. מתואר כאן הוא פרוטוקול אמין המאפשר בידוד יעיל של מיוציטים חדריים מגוף שריר הלב אנושי ובעלי חיים. כדי להגדיל את יחס פני השטח לנפח תוך מזעור נזק לתא, רקמת שריר הלב פרוסות 300 μm עבה נוצרים מדגימות שריר הלב עם ויברטום. פרוסות רקמות מתעכלות לאחר מכן עם פרוטאז וcollagenase. עכברוש שריר הלב שימש כדי לבסס את הפרוטוקול ולכרות את התשואות של מיוציטים קיימא, סידן סובלני על ידי ספירת תאים ציטומטרי זרימה. השוואה עם שיטת נתח רקמות הנפוץ הראה תשואות גבוהות באופן משמעותי של cardiomyocytes בצורת מוט (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, p < 0.05). הפרוטוקול תורגם לכישלון ולא נכשל שריר הלב האנושי, שם התשואות היו דומות כמו שריר הלב חולדה, ושוב, גבוה באופן ניכר מאשר עם שיטת נתח רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים / מ"ג, p < 0.05). במיוחד, עם הפרוטוקול שהוצג ניתן לבודד מספרים סבירים של cardiomyocytes אנושי קיימא (9-200 תאים / מ"ג) מכמויות מינימליות של רקמה (<50 מ ג). לפיכך, השיטה ישימה על שריר הלב בריא ונכשל הן מלבבות האדם והן מלב בעלי החיים. יתר על כן, ניתן לבודד מיוציטים מרגשים והתכווצות מדגימות רקמות אנושיות המאוחסנים עד 36 שעות בתמיסה קרדיופלגית קרה, מה שהופך את השיטה שימושית במיוחד עבור מעבדות במוסדות ללא ניתוח לב באתר.

Introduction

טכניקה שסללה את הדרך לתובנות חשובות על פיזיולוגיה cardiomyocyte היא הבידוד של cardiomyocytes חדרי חיים מלבבות שלמים¹. cardiomyocytes מבודד יכול לשמש כדי ללמוד מבנה תאי נורמלי ותפקוד, או את ההשלכות של ניסויי vivo; לדוגמה, כדי להעריך שינויים אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-ריתוך במודלים של בעלי חיים של מחלות לב. בנוסף, cardiomyocytes מבודד יכול לשמש עבור תרבות תאים, התערבויות תרופתיות, העברת גנים, הנדסת רקמות, ויישומים רבים אחרים. לכן, שיטות יעילות לבידוד cardiomyocyte הן בעל ערך בסיסי למחקר לב בסיסי ותרגום.

קרדיומיוציטים מיונקים קטנים, כגון מכרסמים, ומיונקים גדולים יותר, כגון חזירים או כלבים, מבודדים בדרך כלל על ידי תסיסה כלילית של הלב עם פתרונות המכילים קולאזנס גולמי ו/או פרוטאזים. זה תואר כשיטה “תקן זהב” לבידוד cardiomyocyte, וכתוצאה מכך תשואות של עד 70% של תאים קיימא². הגישה שימשה גם עם לב אנושי, וכתוצאה מכך ניבים cardiomyocyte^{מקובל 3,,4,5}. עם זאת, מכיוון שזמיה כלילית אפשרית רק אם הלב השלם או טריז שריר הלב הגדול המכיל ענף עורק כלילי זמין, רוב דגימות הלב האנושיות אינן מתאימות לגישה זו בשל גודלן הקטן והיעדר כלי דם מתאימים. לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים אנושיים הוא מאתגר.

דגימות שריר הלב האנושי מורכבות בעיקר נתחי רקמה בגודל משתנה (כ 0.5 x 0.5 x 0.5 ס”מ עד 2 x 2 ס”מ), שהושגו באמצעות ביופסיות אנדומיוקרדיאליות⁶, myectomies^{מחיצה 7}, השתלות VAD⁸, או^{מלבבות מושתלים 9}. ההליכים הנפוצים ביותר לבידוד cardiomyocyte להתחיל עם טחינה הרקמה באמצעות מספריים או אזמל. מגעים מתא לתא משובשים לאחר מכן על ידי טבילה במאגרי סידן או סידן נמוך. זה מלווה שלבי עיכול מרובים עם תמציות אנזים גולמי או אנזימים מטוהרים כמו פרוטאזים (למשל, שלושה נסיפסין), קולגן, היאלורונידאז, או אלסטאז, וכתוצאה מכך התפוררות של מטריצה חוץ תאית ושחרור של קרדיומיוציטים. בשלב סופי וקריטי, יש לשחזר בזהירות ריכוז סידן פיזיולוגי, או שנגרם נזק תאי בשל פרדוקס^{הסידן 10,,11,,12}. גישת בידוד זו נוחה אך בדרך כלל לא יעילה. לדוגמה, מחקר אחד מצא כי כמעט 1 גרם של רקמת שריר הלב נדרש כדי להשיג מספר מספיק של cardiomyocytes מתאים לניסויים הבאים¹³. סיבה אפשרית לתשואות נמוכות היא השיטה הקשה יחסית של טחנת הרקמה. זה עלול לגרום נזק במיוחד cardiomyocytes ממוקם בשולי הנתח למרות מיוציטים אלה נוטים ביותר להשתחרר על ידי עיכול אנזימטי.

היבט נוסף שעשוי להשפיע על יעילות הבידוד ואיכות התאים המתקבלים מדגימות אנושיות הוא משך הזמן של איסכמיה של רקמות. רוב הפרוטוקולים מזכירים זמני הובלה קצרים למעבדה כתור מוקדם לתוצאות טובות. זה מגביל את המחקר של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים למעבדות עם מתקני ניתוח לב בקרבת מקום. יחד, הגבלות אלה פוגעות באימות ממצאים חשובים ממודלים של בעלי חיים בקרדיומיוציטים אנושיים. פרוטוקולי בידוד משופרים המאפשרים תפוקות קרדיומיוציט גבוהות מכמויות קטנות של רקמות, רצוי ללא נזק רציני לאחר זמני הובלה ממושכים, ולכן רצויים.

מתואר כאן פרוטוקול בידוד המבוסס על העיכול האנזימטי של פרוסות רקמת שריר הלב דקה שנוצר עם vibratome^14,15. אנו מוכיחים כי בידוד מפרוסות רקמות הוא הרבה יותר יעיל מזה מחתיכות רקמה טחון עם מספריים. השיטה המתוארת לא רק מאפשרת תפוקה גבוהה של cardiomyocytes אנושי קיימא מכמויות קטנות של רקמת שריר הלב, אלא גם ישימה דגימות המאוחסנות או מועברות בתמיסה קרדיופלגית קרה עד 36 שעות.

Protocol

כל הניסויים בחולדות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש Mittelfranken, בוואריה, גרמניה. איסוף ושימוש בדגימות רקמת לב אנושית אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת ארנגן-נירנברג ואוניברסיטת רוהר בוכום. מחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם הכתובה לפ?…

Representative Results

כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול שימש עם שריר הלב חולדה ומספר המיוציטים קיימא כתוצאה מכך הושווה למספרים שהושגו על ידי בידוד באמצעות זביה כלילית ועל ידי בידוד מחתיכות רקמות קטנות (בידוד נתחים, איור 2). בידוד נתחים ובידוד מפרוסות רקמות בוצעו מאותם לבבות. לבידוד באמצעות עי…

Discussion

למרות הבידוד של cardiomyocytes חיים הוקמה לפני יותר מ 40 שנים והוא עדיין תנאי מוקדם עבור גישות ניסיוניות רבות במחקר לב, זה נשאר טכניקה קשה עם תוצאות בלתי צפויות. בידוד Cardiomyocyte באמצעות שאיפה של העורקים הכליליים עם תמיסת אנזים משמש בדרך כלל עבור לבבות של בעלי חיים קטנים ומניב מספר גדול של תאים קיימא. …

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection