진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

Summary

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

Abstract

동물과 인간의 심혼에서 심실 심장 근세포의 격리는 심장 연구에서 근본적인 방법입니다. 동물 심근 세포는 일반적으로 소화 효소와 관상 관상 관류에 의해 격리됩니다. 그러나 인간의 심근 세포를 고립시키는 것은 인간 심근 세포가 일반적으로 관상 동맥 관류를 허용하지 않기 때문에 도전적이며, 대체 절연 프로토콜은 실행 가능한 세포의 가난한 수율을 초래합니다. 또한, 인간의 심근 표본은 드물며 현장 심장 수술을 받는 기관에서만 정기적으로 사용할 수 있습니다. 이것은 인간 심근세포에 동물에서 사실 인정의 번역을 방해합니다. 여기에 설명된 인간 및 동물 심근에서 심실 심근세포의 효율적인 격리를 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜이 있습니다. 세포 손상을 최소화하면서 표면 대 부피 비율을 높이기 위해 심근 조직 슬라이스 300 μm 두께는 진동기를 가진 심근 표본에서 생성됩니다. 조직 조각은 프로테아제와 콜라게나아제로 소화됩니다. 쥐 심근은 유동 세포 계수에 의정서를 확립하고 생존 가능한 칼슘 내성 심근세포의 수율을 정량화하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 사용되는 조직-청크 방법과 비교하여 막대 모양의 심근세포의 상당히 높은 수율을 보였다(41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%, p< 0.05). 프로토콜은 쥐 심근에서와 유사한 수율이 있는 실패하고 실패하지 않는 인간 심근으로 변환되었으며, 다시 조직 청크 방법(45.0 ± 15.0 대 6.87 ± 5.23 세포/mg, p< 0.05)보다 현저하게 높았다. 특히, 제시 된 프로토콜과 함께 가능한 인간의 심근 세포의 합리적인 수를 분리 할 수있다 (9-200 세포 / mg) 조직의 최소한의 양에서 (&50 mg). 따라서, 이 방법은 인간과 동물의 심장 모두에서 건강하고 실패한 심근에 적용가능하다. 더욱이, 감기 심근용액에서 최대 36시간 까지 저장된 인간 조직 표본으로부터 흥분및 수축근구를 분리할 수 있어 현장 심장 수술이 없는 기관의 실험실에 특히 유용한 방법을 렌더링할 수 있다.

Introduction

심근세포 생리학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 길을 열어준 정액 기술은 온전한 심장^1에서살아있는 심실 심근세포의 격리이다. 고립 된 심근 세포는 정상적인 세포 구조 와 기능을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다., 또는 생체 내 실험의 결과; 예를 들어, 세포 전기 생리학 또는 심폐소생 수축 커플링의 변화를 평가하기 위해 심장 질환의 동물 모델에서. 추가적으로, 고립된 심근세포는 세포 배양, 약리학 내정간섭, 유전자 전달, 조직 공학 및 많은 그밖 응용을 위해 이용될 수 있습니다. 따라서 심근세포 분리를 위한 효율적인 방법은 기본 및 번역 심장 연구에 근본적인 가치가 있습니다.

설치류와 같은 작은 포유류와 돼지 나 개와 같은 더 큰 포유동물의 심근세포는 일반적으로 조잡한 콜라게나아제 및 / 또는 프로테아제가 함유 된 용액으로 심장의 관상 동맥 관류에 의해 격리됩니다. 이는 심근세포 분리를 위한 “금본위제” 방법으로 설명되어 있으며, 그 결과 실행 가능한 세포^2의최대 70%의 수율을 초래한다. 접근은 또한 허용심근세포^{산출량 3,,4,45의}결과로, 인간의 심혼과 함께 이용되었습니다. 그러나 관상 동맥 관류는 관상 동맥 가지를 포함하는 온전한 심근 또는 큰 심근 웨지를 사용할 수 있는 경우에만 가능하기 때문에, 대부분의 인간 심장 표본은 그들의 작은 크기와 적당한 혈관의 부족으로 인해 이 접근에 적합하지 않습니다. 따라서 인간의 심근 세포의 고립은 어렵습니다.

인간 심근 표본은 주로 가변 크기의 조직 덩어리(약 0.5 x 0.5 x 0.5 cm ~ 2 x 2 x 2cm)로 구성하며, 끝막생기 생검^6,중격 절제술^7,VAD 이식^8,또는 심어진 하트^9를통해 수득된다. 심근 세포 격리를 위한 일반적인 절차는 가위 또는 메스를 사용하여 조직을 다진 것으로 시작합니다. 세포 대 세포 접촉은 칼슘이 없거나 낮은 칼슘 완충제에 침수하여 중단됩니다. 이것은 원유 효소 추출물 또는 프로테아제 (예 : 트립신), 콜라게나아제, 히알루로니다제 또는 엘라스타제와 같은 정제 효소를 함유한 다중 소화 단계로 이어지며 세포외 매트릭스가 분해되고 심근세포의 해방을 초래합니다. 최종적으로 중요한 단계에서, 생리적 칼슘 농도는 신중하게 회복되어야 하며, 칼슘-역설(10,^{,11,,12)으로}인해 세포 손상이 발생할 수 있다.¹¹ 이 격리 방법은 편리하지만 일반적으로 비효율적입니다. 예를 들어, 한 연구는 심근 조직의 거의 1 g후속 실험에 적합한 심근 세포의 충분한 수를 얻기 위해 필요 했다 발견^13. 낮은 수율에 대 한 가능한 이유는 조직을 다진의 상대적으로 가혹한 방법. 이 심근 세포는 효소 소화에 의해 방출 될 가능성이 가장 높지만 청크 가장자리에 위치한 심근 세포가 특히 손상 될 수 있습니다.

인간 표본에서 얻은 세포의 격리 효율성 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 측면은 조직 허혈의 지속 기간. 대부분의 프로토콜은 좋은 결과를 위한 전제 조건으로 실험실에 짧은 수송 시간을 언급합니다. 이것은 가까운 심장 수술 시설을 가진 실험실에 인간 심실 심근 세포의 연구를 제한합니다. 함께, 이러한 제한은 인간의 심근 세포에 있는 동물 모형에서 중요한 사실 인정의 확인을 방해합니다. 소량의 조직에서 높은 심근세포 수율을 허용하는 향상된 격리 프로토콜은 운송 시간이 연장된 후 심각한 손상없이 바람직하게는 바람직합니다.

여기에 기진도^14,,15로생성된 얇은 심근 조직 슬라이스의 효소 소화에 기초한 격리 프로토콜이다. 우리는 조직 조각에서 격리가 가위로 다진 조직 덩어리에서 그것보다 훨씬 더 효율적이다는 것을 보여줍니다. 설명된 방법은 소량의 심근 조직에서 생존 가능한 인간 심근세포의 높은 수율을 허용할 뿐만 아니라 최대 36시간 동안 차가운 심근용액에 저장되거나 운반된 표본에도 적용가능하다.

Protocol

쥐를 가진 모든 실험은 동물 관리 및 사용 위원회 미텔 프랑켄, 바이에른, 독일에 의해 승인되었습니다. 인간 심장 조직 샘플의 수집 및 사용은 에를랑겐 뉘른베르크 대학과 루르 대학 보훔대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 헬싱키 선언 지침에 따라 연구를 수행했습니다. 환자는 조직 수집 전에 서면 통보 된 동의를 주었습니다. 암컷 위스타 쥐(150-200 g)는 시판?…

Representative Results

격리 효율을 확인하기 위해, 프로토콜은 쥐 심근증과 함께 사용되었고, 실행 가능한 심근세포의 결과 수는 관상 동맥 관류를 통해 격리및 작은 조직 덩어리로부터의 격리에 의해 얻어진 숫자와 비교되었다(청크 절연, 그림 2). 조직 조각으로부터의 청크 격리 및 격리는 동일한 심혼에서 수행되었다. 그러나 관상 동맥 관류를 통한 격리를 위해 온 심장이 사용되었습니다. 관상…

Discussion

살아있는 심근세포의 고립은 40년 전에 확립되었고 여전히 심장 연구에서 많은 실험적 접근법의 전제 조건이지만 예측할 수 없는 결과를 가진 어려운 기술로 남아 있습니다. 효소 용액을 가진 관상 동맥의 관류를 통해 심근 세포 절연은 일반적으로 작은 동물의 심혼을 위해 이용되고 실행 가능한 세포의 다수를 산출합니다. 그러나, 이것은 상대적으로 복잡한 시스템과 전문 지식이 필요합니다. 더…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection