Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Summary

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (<50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Abstract

Die Isolierung ventrikulärer Herzmyozyten aus tierischen und menschlichen Herzen ist eine grundlegende Methode in der Herzforschung. Tierische Kardiomyozyten werden häufig durch koronare Perfusion mit Verdauungsenzymen isoliert. Die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten ist jedoch eine Herausforderung, da menschliche Myokardproben in der Regel keine koronare Perfusion zulassen und alternative Isolationsprotokolle zu schlechten Erträgen lebensfähiger Zellen führen. Darüber hinaus sind humane Myokardproben selten und nur regelmäßig in Einrichtungen mit Herzchirurgie vor Ort verfügbar. Dies erschwert die Übersetzung von Befunden von tierischen in menschliche Kardiomyozyten. Hier wird ein zuverlässiges Protokoll beschrieben, das eine effiziente Isolierung ventrikulärer Myozyten von menschlichem und tierischem Myokard ermöglicht. Um das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhöhen und gleichzeitig die Zellschädigung zu minimieren, werden aus Myokardproben mit einem Vibram eine Dicke von 300 m dicke Myokardscheiben erzeugt. Gewebescheiben werden dann mit Protease und Kollagenase verdaut. Rattenmyokard wurde verwendet, um das Protokoll zu bestimmen und die Erträge lebensfähiger, kalziumtoleranter Myozyten durch strömungszytometrische Zellzählung zu quantifizieren. Der Vergleich mit der häufig verwendeten Gewebe-Chunk-Methode zeigte signifikant höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %, p < 0,05). Das Protokoll wurde in versagendes und nicht versagendes menschliches Myokard übersetzt, wo die Erträge ähnlich waren wie bei Rattenmyokard und wiederum deutlich höher als bei der Gewebe-Chunk-Methode (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, p < 0,05). Insbesondere mit dem vorgelegten Protokoll ist es möglich, eine angemessene Anzahl lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten (9–200 Zellen/mg) aus minimalen Gewebemengen (<50 mg) zu isolieren. So ist die Methode auf gesundes und versagendes Myokard sowohl von menschlichen als auch tierischen Herzen anwendbar. Darüber hinaus ist es möglich, erregbare und kontraktile Myozyten aus menschlichen Gewebeproben zu isolieren, die bis zu 36 h in kalter kardioplegischer Lösung gelagert werden, was die Methode besonders nützlich für Laboratorien in Einrichtungen ohne Herzchirurgie vor Ort macht.

Introduction

Eine wegweisende Technik, die den Weg zu wichtigen Einblicken in die Kardiomyozytenphysiologie geebnet hat, ist die Isolierung lebender ventrikulärer Kardiomyozyten von intakten Herzen¹. Isolierte Kardiomyozyten können verwendet werden, um normale zelluläre Struktur und Funktion zu studieren, oder die Folgen von In-vivo-Experimenten; zum Beispiel, um Veränderungen in der zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung in Tiermodellen von Herzerkrankungen zu bewerten. Darüber hinaus können isolierte Kardiomyozyten für Zellkultur, pharmakologische Interventionen, Gentransfer, Tissue Engineering und viele andere Anwendungen verwendet werden. Effiziente Methoden zur Kardiomyozytenisolation sind daher von grundlegender Bedeutung für die Grundlagen- und Translational-Herzforschung.

Kardiomyozyten von kleinen Säugetieren, wie Nagetieren, und von größeren Säugetieren, wie Schweinen oder Hunden, werden häufig durch koronare Perfusion des Herzens mit Lösungen isoliert, die rohe Kollagenatonse und/oder Proteasen enthalten. Dies wurde als die “Goldstandard”-Methode für die Kardiomyozytenisolation beschrieben, was zu Erträgen von bis zu 70% der lebensfähigen Zellen²führt. Der Ansatz wurde auch mit menschlichen Herzen verwendet, was zu akzeptablen Kardiomyozytenerträgen^3,4,5. Da jedoch eine koronare Perfusion nur möglich ist, wenn das intakte Herz oder ein großer Myokardkeil mit einem koronaren Herzzweig zur Verfügung steht, sind die meisten menschlichen Herzproben aufgrund ihrer geringen Größe und des Mangels an geeigneter Gefäße für diesen Ansatz nicht geeignet. Daher ist die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten eine Herausforderung.

Menschliche Myokardproben bestehen meist aus Gewebestücken variabler Größe (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm bis 2 x 2 x 2 cm), die durch endomyocardiale Biopsien⁶, septale Myektomien⁷, VAD-Implantationen⁸oder aus explantierten Herzen⁹. Die häufigsten Verfahren für die Kardiomyozytenisolation beginnen mit dem Hacken des Gewebes mit einer Schere oder einem Skalpell. Zell-zu-Zell-Kontakte werden dann durch Eintauchen in kalziumfreie oder kalziumarme Puffer gestört. Es folgen mehrere Verdauungsschritte mit Rohenzymextrakten oder gereinigten Enzymen wie Proteasen (z.B. Trypsin), Kollagenase, Hyaluronidase oder Elastase, was zu einem Zerfall der extrazellulären Matrix und der Befreiung von Kardiomyozyten führt. In einem letzten, kritischen Schritt muss eine physiologische Kalziumkonzentration sorgfältig wiederhergestellt werden, oder zelluläre Schäden können aufgrund des Calcium-Paradoxons^10,11,12auftreten. Dieser Isolationsansatz ist praktisch, aber in der Regel ineffizient. Eine Studie ergab beispielsweise, dass fast 1 g Myokardgewebe erforderlich waren, um eine ausreichende Anzahl von Kardiomyozyten zu erhalten, die für nachfolgende Experimente geeignet sind¹³. Ein möglicher Grund für niedrige Erträge ist die relativ harte Methode, das Gewebe zu hacken. Dies kann besonders kardiomyozyten an den Klodrändern beschädigen, obwohl diese Myozyten am ehesten durch enzymatische Verdauung freigesetzt werden.

Ein weiterer Aspekt, der die Isolationseffizienz und -qualität der aus menschlichen Proben gewonnenen Zellen beeinflussen kann, ist die Dauer der Gewebeischämie. Die meisten Protokolle nennen kurze Transportzeiten ins Labor als Voraussetzung für gute Ergebnisse. Dies beschränkt die Untersuchung von humanventrikulären Kardiomyozyten auf Laboratorien mit nahe gelegenen Herzchirurgie-Einrichtungen. Zusammen behindern diese Einschränkungen die Überprüfung wichtiger Erkenntnisse von Tiermodellen in menschlichen Kardiomyozyten. Verbesserte Isolationsprotokolle, die hohe Kardiomyozytenausbeuten aus kleinen Gewebemengen ermöglichen, vorzugsweise ohne schwerwiegende Schäden nach längeren Transportzeiten, sind daher wünschenswert.

Beschrieben wird hier ein Isolationsprotokoll, das auf der enzymatischen Verdauung dünner Myokardgewebescheiben basiert, die mit einem Vibratom^14,15erzeugt werden. Wir zeigen, dass die Isolierung von Gewebescheiben viel effizienter ist als die von Gewebestücken, die mit einer Schere gehackt werden. Die beschriebene Methode ermöglicht nicht nur hohe Erträge lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten aus kleinen Mengen Myokardgewebe, sondern ist auch auf Proben anwendbar, die in kalter kardioplegischer Lösung bis zu 36 h gelagert oder transportiert werden.

Protocol

Alle Versuche mit Ratten wurden vom Tierschutz- und Einsatzausschuss Mittelfranken, Bayern, genehmigt. Die Entnahme und Verwendung menschlicher Herzgewebeproben wurde von den Institutionellen Fachkollegien der Universität Erlangen-Nürnberg und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Die Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage vor der Gewebeentnahme ab. Weibliche Wistar-Ratten (15…

Representative Results

Um die Isolationseffizienz zu überprüfen, wurde das Protokoll mit Rattenmyokard verwendet und die resultierende Anzahl lebensfähiger Myozyten wurde mit den Zahlen verglichen, die durch Isolierung durch koronare Perfusion und durch Isolierung von kleinen Gewebestücken (Chunk-Isolation, Abbildung 2). Chunk Isolation und Isolierung von Gewebescheiben wurden von den gleichen Herzen durchgeführt. Für die Isolierung durch koronare Perfusion wurde jedoch das ganze Herz verwendet. Die koronare…

Discussion

Obwohl die Isolation lebender Kardiomyozyten vor mehr als 40 Jahren etabliert wurde und immer noch eine Voraussetzung für viele experimentelle Ansätze in der Herzforschung ist, bleibt sie eine schwierige Technik mit unvorhersehbaren Ergebnissen. Die Kardiomyozytenisolation durch Perfusion der Herzkranzgefäße mit Enzymlösung wird häufig für Herzen von Kleintieren verwendet und liefert eine große Anzahl lebensfähiger Zellen. Dies erfordert jedoch ein relativ komplexes System und Fachwissen. Darüber hinaus sind di…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection