Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor

Summary

Presenteras är ett protokoll för isolering av mänskliga och animaliska Ventrikulärt kardiomyocyter från vibratome-cut hjärtinfarkt skivor. Höga utbyten av kalciumtoleranta celler (upp till 200 celler/mg) kan erhållas från små mängder vävnad (<50 mg). Protokollet är tillämpligt på myokardium som utsätts för kallischemi i upp till 36 h.

Abstract

Isoleringen av ventrikulära hjärt myocyter från djur och mänskliga hjärtan är en grundläggande metod i hjärtforskning. Animal kardiomyocyter är vanligen isolerade av koronar perfusion med matsmältningsenzymer. Att isolera mänskliga kardiomyocyter är dock utmanande eftersom mänskliga hjärtinfarkt exemplar vanligtvis inte tillåter för koronar perfusion, och alternativa isolering protokoll resultera i dålig avkastning av livskraftiga celler. Dessutom är mänskliga hjärtinfarkt exemplar sällsynta och endast regelbundet tillgängliga på institutioner med på plats hjärtkirurgi. Detta hämmar översättningen av resultaten från djur till mänskliga kardiomyocyter. Beskrivs här är ett tillförlitligt protokoll som möjliggör effektiv isolering av ventrikulära myocyter från människors och djurs myokardium. För att öka förhållandet mellan ytan och volym och samtidigt minimera cellskador genereras myokardvävnadsskivor 300 μm tjocka från myokardexemem med en vibratom. Vävnadsskivor rötas sedan med proteas och kollagenas. Råttan hjärtmuskel användes för att fastställa protokollet och kvantifiera avkastningen av livskraftiga, kalcium-toleranta myocyter genom flöde-cytometric cell räkna. Jämförelse med den vanligen använda vävnad-chunk metoden visade betydligt högre avkastning av stavformade kardiomyocyter (41,5 ± 11,9 vs 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollet översattes till sviktande och icke-sviktande humant hjärtmuskelium, där avkastningen var liknande som i råtta myokardium och, återigen, markant högre än med vävnad-chunk metoden (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 celler/mg, p < 0,05). Noterbart, med det presenterade protokollet är det möjligt att isolera rimligt antal livskraftiga mänskliga kardiomyocyter (9–200 celler/mg) från minimala mängder vävnad (<50 mg). Således är metoden tillämplig på friska och sviktande myokardium från både mänskliga och djuriska hjärtan. Vidare är det möjligt att isolera retbara och kontraktila myocyter från mänskliga vävnadsprover som lagras i upp till 36 h i kall kardioplegisk lösning, vilket gör metoden särskilt användbar för laboratorier vid institutioner utan hjärtkirurgi på plats.

Introduction

En banbrytande teknik som har banat väg för viktiga insikter i kardiomyocyte fysiologi är isoleringen av levande ventrikulära kardiomyocyter från intakta hjärtan¹. Isolerade kardiomyocyter kan användas för att studera normal cellulär struktur och funktion, eller konsekvenserna av in vivo experiment; till exempel att bedöma förändringar i cellulär elektrofysiologi eller excitation-kontraktionskoppling i djurmodeller av hjärtsjukdom. Dessutom, isolerade kardiomyocyter kan användas för cellodling, farmakologiska insatser, genöverföring, vävnadsteknik, och många andra tillämpningar. Därför är effektiva metoder för kardiomyocyteisolering av grundläggande värde för grundläggande och translationell hjärtforskning.

Kardiomyocyter från små däggdjur, såsom gnagare, och från större däggdjur, såsom svin eller hundar, är ofta isolerade genom koronarperfusion av hjärtat med lösningar som innehåller råkollagen och/eller proteaser. Detta har beskrivits som “guldmyntfoten” metod för kardiomyocyte isolering, vilket resulterar i avkastning på upp till 70% av livskraftiga celler². Tillvägagångssättet har också använts med mänskliga hjärtan, vilket resulterar i acceptabla kardiomyocyte^{avkastning 3,4,5}. Men eftersom koronar perfusion är endast genomförbart om intakt hjärta eller en stor hjärtinfarkt kil som innehåller en födans gatan gren är tillgängliga, de flesta mänskliga hjärt exemplar är inte lämpade för detta tillvägagångssätt på grund av deras ringa storlek och en brist på lämpliga vasculature. Därför är isoleringen av mänskliga kardiomyocyter utmanande.

Mänskliga myokardprover består mestadels av vävnadsbitar av variabel storlek (ungefär 0,5 x 0,5 x 0,5 cm till 2 x 2 x 2 cm), som erhålls genom endomyocardial biopsier⁶, septal myectomies⁷, VAD implantationer⁸, eller från explanterade hjärtan⁹. De vanligaste procedurerna för kardiomyocyteisolering börjar med att hacka vävnaden med hjälp av sax eller en skalpell. Cell-till-cell kontakter störs sedan genom nedsänkning i kalcium-fri eller låg kalcium buffertar. Detta följs av flera matsmältningssteg med rå enzym extrakt eller renat enzymer som proteaser (t.ex., trypsin), kollagenas, hyaluronidas, eller elastase, vilket resulterar i en sönderfall av extracellulära matris och befrielse av kardiomyocyter. I ett sista, kritiskt steg, en fysiologisk kalciumkoncentration måste noggrant återställas, eller cellulära skador kan uppstå på grund av kalcium-paradox^10,11,12. Denna isolering strategi är bekvämt men oftast ineffektivt. Till exempel fann en studie att nästan 1 g myokardvävnad krävdes för att få ett tillräckligt antal kardiomyocyter som lämpar sig för efterföljande experiment¹³. En möjlig orsak till låga avkastningar är den relativt hårda metoden att malet vävnaden. Detta kan särskilt skada kardiomyocyter ligger vid bit kanter även om dessa myocyter är mest sannolikt att släppas av enzymatisk matsmältning.

En annan aspekt som kan påverka isolering effektivitet och kvalitet av celler som erhållits från mänskliga exemplar är varaktigheten av vävnad ischemi. De flesta protokoll nämner korta transporttider till laboratoriet som en förutsättning för goda resultat. Detta begränsar studiet av mänskliga ventrikulära kardiomyocyter till laboratorier med närliggande hjärtkirurgi anläggningar. Tillsammans hämmar dessa restriktioner verifieringen av viktiga fynd från djurmodeller i humana kardiomyocyter. Förbättrad isolering protokoll som möjliggör hög kardiomyocyte avkastning från små mängder vävnad, helst utan allvarliga skador efter utökade transporttider, är därför önskvärt.

Beskrivs här är en isolering protokoll som bygger på den enzymatiska matsmältningen av tunna myokardvävnad skivor som genereras med en vibratom^14,15. Vi visar att isolering från vävnad skivor är mycket effektivare än från vävnad bitar malet med sax. Den beskrivna metoden möjliggör inte bara hög avkastning av livskraftiga humana kardiomyocyter från små mängder av myokardvävnad utan är också tillämplig på exemplar som lagras eller transporteras i kall kardioplegiclösning i upp till 36 h.

Protocol

Alla experiment med råttor godkändes av Djurvårds- och användningskommittén Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Insamling och användning av mänskliga hjärtvävnadsprover godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid universitetet i Erlangen-Nürnberg och Ruhr-universitetet Bochum. Studier genomfördes enligt Helsingforsdeklarationens riktlinjer. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke före vävnadsinsamlingen. Kvinnliga Wistar råttor (150 –200 g) erhölls kom…

Representative Results

För att verifiera isoleringseffektiviteten användes protokollet med råttmokardium och det resulterande antalet livskraftiga myocyter jämfördes med de siffror som erhölls genom isolering via koronarperfusion och genom isolering från små vävnadsbitar (bitisolering, Bild 2). Chunk isolering och isolering från vävnad skivor utfördes från samma hjärtan. För isoleringen via koronarperfusion, dock, hela hjärtat användes. Koronar perfusion gett övervägande stav-formad och tvärstr…

Discussion

Även om isoleringen av levande kardiomyocyter inrättades för mer än 40 år sedan och är fortfarande en förutsättning för många experimentella metoder i hjärtforskning, är det fortfarande en svår teknik med oförutsägbara resultat. Kardiomyocyte isolering via perfusion av kranskärlen med enzymlösning används ofta för hjärtan av små djur och ger ett stort antal livskraftiga celler. Detta kräver dock ett relativt komplicerat system och expertis. Vidare är de flesta mänskliga vävnadsprover inte lämpad…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection