Isolatie en cultuur van primaire neuronen en Glia van volwassen rat urineblaas
Summary
Dit protocol probeert een herhaalbaar protocol vast te stellen voor primaire neuronen en glia-isolatie van rattenblaas voor verdere cellulaire experimenten.
Abstract
De onderste urinewegen hebben twee hoofdfuncties, namelijk periodieke urineopslag en mictie; deze functies worden gemedieerd door middel van centrale en perifere neuroregulatie. Hoewel uitgebreid onderzoek naar het zenuwstelsel van de onderste urinewegen is uitgevoerd, hebben de meeste studies zich gericht op primaire cultuur. Dit protocol introduceert een methode voor de isolatie en cultuur van blaasneuronen en glia van Sprague-Dawley ratten. Bij deze methode werden de neuronen en glia gedurende 5-7 dagen geïncubeerd in een couveuse van 37 °C, 5% CO2. Als gevolg hiervan groeiden ze uit tot volwassen vormen die geschikt waren voor gerelateerde daaropvolgende immunofluorescentie-experimenten. Cellen werden morfologisch waargenomen met behulp van een optische microscoop. Neuronen, synaptische blaasjes en glia werden geïdentificeerd door respectievelijk β-III-tubuline en MAP-2, Synapsin-1 en GFAP-kleuring. Ondertussen, immunocytochemie werd uitgevoerd op verschillende neurotransmitter-gerelateerde eiwitten, zoals choline acetyltransferase, DYNLL2, en SLC17A9.
Introduction
De onderste urinewegen hebben twee hoofdfuncties: periodieke urineopslag en mictie1. Het lagere urinewegen zenuwstelsel (LUTNS) controleert deze functies en is delicaat en vatbaar voor vele neuropathieën, die aangeboren (porfyrie), verworven (ziekte van Lyme), secundair aan ziektetoestanden (diabetische cystopathie), geneesmiddel geïnduceerd (hemorragische cystitis), chirurgie veroorzaakt (abdominoperineale resectie), of letsel veroorzaakt (traumatische dwarslaesie)2,3,4,5,6,7. In fysiologische/pathologische studies zijn in vivo en in vitro experimenten even belangrijk. Hoewel in vivo onderzoek naar LUTNS al enige tijd op orgaan-, cellulair en moleculair niveau wordt uitgevoerd, is in vitro onderzoek naar primaire neuronen uit de urineblaas bijna onbestaande8,9. Hoewel de huidige studie beperkt is, hopen we het onderzoek op dit gebied te pionieren, zodat andere onderzoekers het kunnen verbeteren. Op deze manier kan deze co-cultuur leiden tot een cellulair begrip van fysiologische disfunctie in fenotypes, zoals blaasneurondisfunctie.
In tegenstelling tot enterische spieren met een duidelijke directionaliteit van de spiercellen in discrete lagen, zijn de spieren van de blaas ongeorganiseerd10. Daarom stelt deze methode voor om in plaats van de buitenste laag van de blaas af te pellen, de hele blaas te verteren om de moeilijkheidsgraad van de werking te verminderen en de voorverwerkingstijd te verkorten voor een hoge celoverlevingssnelheid.
Volgens deze methode kunnen we een gemengde cultuur van neuronen en andere cellen verkrijgen. De andere cellen zijn onmisbaar omdat hun aanwezigheid een in vivo omgeving nabootst11. Bovendien leveren dergelijke cellen de stoffen die niet beschikbaar zijn in het medium.
Deze methode omvat twee stappen voor de spijsvertering. Ten eerste wordt collagenase type II gebruikt om collageen te hydrolyseren, gevolgd door trypsine, om het weefsel te dissocieren in cellen10. Op deze manier worden blaasweefsels verspreid in enkele cellen en groeien ze vervolgens relatief onafhankelijk. Wanneer de cultuur van neuronen rijpt, kunnen de neuronen worden gebruikt voor beeldvorming of functionele assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Voorbereiding van de plaat
Het gebruik van glasafdekkingslips in 6-, 12- of 48-putkweekplaten voor immunofluorescente of calciumbeeldvormingsexperimenten is een economische en monstersparende operatie. Cellen groeien goed in platen zonder afdeklips tijdens de bereiding van primaire celculturen. Daarom zijn coverslips overbodig in experimenten, zoals westerse vlek of polymerasekettingreactie. Bovendien is coaten een noodzakelijke stap voor het plateren van cellen, met of zonder afdeklips. Laminine e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81673676) en Dongguan Science and Technology Bureau (Grant no. 2019622101002). De auteurs danken Dr. Maryrose Sullivan (Assistant Professor in Surgery, Harvard Medical School) voor technisch advies.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
Riferimenti
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
