Övervakad maskininlärning för semikvantifiering av extracellulärt DNA i Glomerulonefrit
Summary
Extracellulärt DNA (ecDNA) som frigörs under celldöd är proinflammatoriskt och bidrar till inflammation. Mätning av ecDNA på skadeplatsen kan bestämma effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Detta protokoll beskriver användningen av ett verktyg för maskininlärning för att automatisera mätning av ecDNA i njurvävnad.
Abstract
Glomerular cell död är en patologisk funktion i myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppar associerade vaskulit (MPO-AAV). Extracellulär deoxyribonucleic syra (ecDNA) frigörs under olika former av celldöd inklusive apoptos, nekros, nekros, neutrofil extracellulära fällor (NETs) och pyroptos. Mätning av denna celldöd är tidskrävande med flera olika biomarkörer som krävs för att identifiera de olika biokemiska formerna av celldöd. Mätning av ecDNA utförs i allmänhet i serum och urin som ett surrogat för njurskada, inte i det faktiska målorganet där den patologiska skadan uppstår. Den nuvarande svårigheten att undersöka ecDNA i njurarna är bristen på metoder för formalin fast paraffin inbäddade vävnad (FFPE) både experimentellt och i arkiverade mänskliga njure tarmbiopsier. Detta protokoll ger en sammanfattning av de steg som krävs för att färga för ecDNA i FFPE vävnad (både mänskliga och murine), släcka autofluorescens och mäta ecDNA i de resulterande bilderna med hjälp av en verktygsinlärningsverktyg från allmänt tillgängliga öppen källkod ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering tillämpas på ecDNA inom glomeruli där programmet lär sig att klassificera ecDNA. Denna klassificerare tillämpas på efterföljande förvärvade njurbilder, vilket minskar behovet av manuella anteckningar för varje enskild bild. Anpassningsförmågan hos den trainable Weka segmenteringen visas vidare i njurvävnad från experimentella murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), att identifiera NETs och ecMPO, gemensamma patologiska bidragsgivare till anti-MPO GN. Denna metod ger objektiv analys av ecDNA i njurvävnad som tydligt visar den effekt i vilken det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skilja ecDNA mellan friska normala njurvävnad och sjuk njurvävnad. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att identifiera ecDNA, NETs och ecMPO i andra organ.
Introduction
Myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppssasocierade vaskulit (MPO-AAV) är en autoimmun sjukdom som resulterar i njursvikt från patologisk glomerär skada med betydande celldöd och frisättning av deoxyribonukleinsyra (DNA)1,2. DNA kan aktivera immunsystemet genom att fungera som en varningssignal. Under normala hälsosamma förhållanden erbjuder dna-kärnan skydd mot exponering för immunsystemet. Själv-DNA som frigörs extracellulärt under antingen patogena processer eller autoimmunitet ses av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skada associerad molekylärt självprotein (DAMP)3. Extra cellulärt DNA (ecDNA) frigörs från döende celler genom flera olika mekanismer som styrs av olika biokemiska vägar, såsom apoptos, nekrotosis neutrofil extracellulär fällabildning (NETs), nekros eller pyroptos4,,5,,6,,7,8.
Vi beskriver häri metoder för att färga och mäta ecDNA frigörs från döende celler i delar av formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) njurar från experimentella anti-MPO GN och njurbiopsier från patienter med MPO-AAV9,10. Det finns flera metoder för påvisande av cirkulation av dubbelsträngat DNA (dsDNA) och DNA-komplex från både serum och urin och från in vitro-analyser11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta vid fastställandet av mängden ecDNA, bestämmer inte var ecDNA frigörs anatomiskt. Det finns metoder som beskriver specifik mätning av ecDNA såsom tunel för apoptos och mätning av cellskräp13,14. Det finns ingen metod som beskriver mätning ecDNA kulminerade från alla former av celldöd i FFPE njurar där den patologiska skadan uppstår. Detta är viktigt att avgöra om experimentella terapeutiska behandlingar rensar ecDNA från platserna för patologisk skada i det faktiska målorganet.
Förvärvet av flera bilder från njurprover skapar en stor mängd data som analyseras ofta av en enda användare. Detta är arbetsintensivt, tidskrävande och kan bli föremål för opålitlig reproducerbarhet av andra användare, på grund av användarens partiskhet. Trainable Weka segmentering är en öppen källkod plugin för ImageJ som använder framkant bioinformatiska verktyg för att klassificera pixlar med hjälp av maskininlärning algoritmer15,16. Denna metod är “trainable” där den lär sig från användarens klassificering av segment av pixlar och tillämpar den nya inlärd klassificering till andra bilder. Den här metoden bygger på vanliga analysverktyg i ImageJ-programmet som används för att “klassificera” varje pixel i ett segment som tillhör en viss “klass”. När programmet lär sig “klassificerare”, kan de användas för att identifiera andra liknande klassificerade segment inom samma bild. Den här modellen sparas och tillämpas sedan på andra uppsättningar bilder i samma experiment.
Aktuella hinder för att bestämma ecDNA in situ i njure sektioner är endogena autofluorescens från fixering i formalin och arbetsintensiv analys av bilderna. Vi beskriver här hur man släcka denna autofluorescens, upptäcka ecDNA och använda övervakad maskininlärning för hög genomströmning mätning av ecDNA. Vi har tidigare publicerat mätning av unga som varken arbetar eller studerar med hjälp av ett makro i ImageJ, vi visar nu semi automatisering av dessa metoder med hjälp av övervakad maskininlärning1. Vi visar att maskininlärningsverktyget är anpassningsbart för att klassificera en alternativ fläck för unga som varken arbetar eller studerar inom samma bild. Dessa färgningsmetoder som beskrivs här för att upptäcka ecDNA, NETs och ecMPO kan översättas till andra fasta organ och sjukdomar där ecDNA, NETS och ecMPO spelar en roll för att vidmakthålla sjukdomar såsom reumatoid artrit och lupus17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera protokoll finns som mäter proinflammatory markörer i serum och urin av både patienter och mus modeller av glomerulonefrit. Detta beskrivna protokoll möjliggör analys av produkter av celldöd (ecDNA, NETs och ecMPO) inom glomerulus direkt. De viktigaste stegen i detta protokoll är vävnadsberedning och avbildning. Den viktigaste begränsa inslag av att använda en fluorescerande färgning metod för analys är vävnad autofluorescens. Formalin fast paraffinvävnad är föremål för autofluorescens som kan sky…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar Monash Micro Imaging för användning av Nikon C1 upprätt confocal laserscanning mikroskop och Monash Histology Platform för bearbetning av njurvävnad.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
Riferimenti
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
