In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Summary

Descritto qui è un metodo per utilizzare gli embrioni di pesce zebra per studiare la capacità delle nanoparticelle funzionalizzate di colpire le cellule tumorali umane in vivo. Questo metodo consente la valutazione e la selezione di nanoparticelle ottimali per test futuri su animali di grandi dimensioni e in studi clinici.

Abstract

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse nel campo della nanomedicina. I modelli animali in vivo sono necessari per colmare la nanotecnologia con la sua applicazione biomedica. Il topo rappresenta il modello animale tradizionale per la prova preclinica; tuttavia, i topi sono relativamente costosi da mantenere e hanno lunghi cicli sperimentali a causa della progenie limitata da ogni madre. Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per la ricerca sullo sviluppo e biomedica, compresa la ricerca sul cancro. In particolare, grazie alla sua trasparenza ottica e al rapido sviluppo, gli embrioni di pesce zebra sono adatti per il monitoraggio in tempo reale in vivo del comportamento delle cellule tumorali e delle loro interazioni con il loro microambiente. Questo metodo è stato sviluppato per introdurre in sequenza le cellule tumorali umane e le nanoparticelle funzionalizzate negli embrioni trasparenti di pesce zebra Casper e monitorare il riconoscimento in vivo e il targeting delle cellule tumorali da parte delle nanoparticelle in tempo reale. Questo protocollo ottimizzato mostra che le nanoparticelle etichettate in fluorescenza, che sono funzionalizzate con gruppi di folati, possono riconoscere e colpire specificamente le cellule tumorali epiteliali cervicali umane metastatiche etichettate con un'altra fluorochroma. Il processo di riconoscimento e targeting può avvenire già 30 minuti postinizione delle nanoparticelle testate. L'intero esperimento richiede solo l'allevamento di poche coppie di pesci adulti e richiede meno di 4 giorni per essere completato. Inoltre, gli embrioni di pesce zebra non dispongono di un sistema immunitario adattivo funzionale, che consente l'innesto di una vasta gamma di cellule tumorali umane. Pertanto, l'utilità del protocollo qui descritto consente il test di nanoparticelle su vari tipi di cellule tumorali umane, facilitando la selezione di nanoparticelle ottimali in ogni contesto di cancro specifico per i futuri test nei mammiferi e nella clinica.

Introduction

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse sia per i fisici che per i ricercatori biomedici. L'emergere della nanomedicina ha portato allo sviluppo di diverse nanoparticelle, come quelle coniugate con ligande bersaglio e/o farmaci chemioterapici^1,2,3. Le proprietà aggiunte delle nanoparticelle consentono la loro interazione con il sistema biologico, rilevando e monitorando gli eventi biologici con alta efficienza e precisione insieme ad applicazioni terapeutiche. Le nanoparticelle di oro e ossido di ferr....

Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Boston University School of Medicine nell'ambito del protocollo: PROTO201800543.

1. Generazione di embrioni di pesce zebra Casper

1. Scegli pesci Casper adulti di almeno 3 mesi di età per l'allevamento naturale per generare embrioni trasparenti di pesce zebra Casper.
2. Riempire le vasche di accoppiamento a due camere con acqua di pesce la sera, separare le vasche superiori con divisori, posizionare un pesce maschio in un lato della camera e uno o due pesci femmina nell'altro l....

Results

Lo schema del protocollo illustrato nella Figura 1 illustra le procedure generali per questo studio. Sono stati allevati pesci adulti maschi e femmine trasparenti Casper per generare embrioni (sezione 1). Le cellule di HeLa di RFP sono state iniettate nell'area vascolarizzata sotto la cavità pervitellina degli embrioni di pesce zebra a 48 hpf, con embrioni non iniettati come controlli (sezione 3). Per gli individui con esperienza nella microiniezione.......

Discussion

Il protocollo qui descritto utilizza il pesce zebra come un sistema in vivo per testare la capacità delle nanoparticelle di riconoscere e colpire le cellule tumorali umane metastatiche. Diversi fattori possono influire sul successo dell'esecuzione degli esperimenti. In primo luogo, gli embrioni devono essere completamente sviluppati a 48 hpf. La corretta fase di sviluppo degli embrioni consente loro di sopportare e sopravvivere al trapianto di cellule tumorali umane. Gli embrioni di età inferiore a 48 hpf hanno un tasso .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio	KSE scientific	BMK-A1705
Capillari in vetro borosilicato	World Precision Instruments	1,0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer e monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	venduto da Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Incubatrice per pesci	VWR	35960-056
Emocitometro	Fishersci marca	02-671-51B
Supporto magnetico	World Precision Instruments	M10
Punta per microloader	Eppendorf	E5242956003	venduto da Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Estrattore di aghi	Strumenti Sutter	P-97
Microscopio fluorescente Olympus MVX-10	Punta Olympus	MVX-10
P200	Marca Fishersci	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	venduto da Fisher
Piastra Petri	Corning	SB93102	venduto da Fisher
Pipetta in plastica	Fishersci marca	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pompa pneumatica pico	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Prodotto Roche realizzato da Sigma- venduto da Fisher
Lama di rasoio	Fishersci marca	12-640
SZ51 microscopio di dissezione	Olympus	SZ51
Tricaina metansolfonato	Western Chemicals	NC0872873	venduto da Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	venduto da Fisher
Tweezer	Fishersci marca	12-000-122