In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish
Summary
Hier beschreven is een methode voor het gebruik van zebravis embryo’s om het vermogen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes te bestuderen om menselijke kankercellen in vivo richten. Deze methode maakt de evaluatie en selectie van optimale nanodeeltjes mogelijk voor toekomstige tests bij grote dieren en in klinische proeven.
Abstract
Het ontwikkelen van nanodeeltjes die kankercellen kunnen detecteren, richten en vernietigen is van groot belang op het gebied van nanogeneeskunde. In vivo diermodellen zijn nodig voor het overbruggen van de nanotechnologie tot de biomedische toepassing ervan. De muis vertegenwoordigt het traditionele diermodel voor preklinische tests; muizen zijn echter relatief duur om te houden en hebben lange experimentele cycli vanwege het beperkte nageslacht van elke moeder. De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem voor ontwikkelings- en biomedisch onderzoek, waaronder kankeronderzoek. Met name vanwege de optische transparantie en snelle ontwikkeling zijn zebravisembryo’s zeer geschikt voor real-time in vivo monitoring van het gedrag van kankercellen en hun interacties met hun micro-omgeving. Deze methode is ontwikkeld om achtereenvolgens menselijke kankercellen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes in transparante Casper zebrafish embryo’s te introduceren en in vivo herkenning en targeting van de kankercellen door nanodeeltjes in real time te monitoren. Dit geoptimaliseerde protocol toont aan dat fluorescerend gelabelde nanodeeltjes, die zijn gefunctionaliseerd met foliumzuurgroepen, specifiek gemetastaseerde menselijke cervicale epitheelkankercellen kunnen herkennen en targeten die zijn voorzien van een ander fluorchroom. De erkenning en targeting proces kan plaatsvinden al 30 min postinjectie van de nanodeeltjes getest. Het hele experiment vereist alleen het fokken van een paar paar volwassen vissen en duurt minder dan 4 dagen om te voltooien. Bovendien missen zebravisembryo’s een functioneel adaptief immuunsysteem, waardoor een breed scala aan menselijke kankercellen kan worden geëntreerd. Vandaar dat het nut van het hier beschreven protocol het testen van nanodeeltjes op verschillende soorten menselijke kankercellen mogelijk maakt, waardoor de selectie van optimale nanodeeltjes in elke specifieke kankercontext voor toekomstige tests bij zoogdieren en de kliniek wordt vergemakkelijkt.
Introduction
De ontwikkeling van nanodeeltjes die in staat zijn om kankercellen te detecteren, te richten en te vernietigen is van groot belang voor zowel natuurkundigen als biomedische onderzoekers. De opkomst van nanogeneeskunde leidde tot de ontwikkeling van verschillende nanodeeltjes, zoals die vervoegd met gerichte liganden en/of chemotherapeutische geneesmiddelen1,2,3. De toegevoegde eigenschappen van nanodeeltjes maken hun interactie met het biologische systeem, het waarmaken en monitoren van biologische gebeurtenissen met een hoge efficiëntie en nauwkeurigheid, samen met therapeutische toepassingen mogelijk. Goud en ijzeroxide nanodeeltjes worden voornamelijk gebruikt in computertomografie en magnetische resonantie imaging toepassingen, respectievelijk. Terwijl de enzymatische activiteiten van goud en ijzeroxide nanodeeltjes het mogelijk maken de detectie van kankercellen door middel van colorimetrische tests, fluorescerende nanodeeltjes zijn zeer geschikt voor in vivo imaging toepassingen4. Onder hen, ultrabright fluorescerende nanodeeltjes zijn bijzonder gunstig, vanwege hun vermogen om kankers vroeg op te sporen met minder deeltjes en verminderde toxiciteiten5.
Ondanks deze voordelen vereisen nanodeeltjes experimenten met in vivo diermodellen voor de selectie van geschikte nanomaterialen en optimalisatie van het syntheseproces. Bovendien, net als geneesmiddelen, nanodeeltjes vertrouwen op dierlijke modellen voor preklinische testen om hun werkzaamheid en toxiciteit te bepalen. Het meest gebruikte preklinische model is de muis, een zoogdier waarvan het onderhoud relatief hoge kosten met zich meebrengt. Voor kankerstudies worden genetisch gemanipuleerde muizen of xenografted muizen meestal gebruikt6,7. De lengte van deze experimenten strekt zich vaak uit van weken tot maanden. In het bijzonder worden kankercellen voor kankermetastasestudies rechtstreeks geïnjecteerd in de bloedsomloop van de muizen op locaties zoals staartaderen en milt8,9,10. Deze modellen vertegenwoordigen alleen de eindstadia van metastase wanneer tumorcellen buitenaardsen en koloniseren verre organen. Bovendien, als gevolg van zichtbaarheid problemen, is het bijzonder uitdagend om tumorcel migratie en nanodeeltjes targeting van tumorcellen in muizen te controleren.
De zebravis (Danio rerio) is uitgegroeid tot een krachtig gewerveld systeem voor kankeronderzoek als gevolg van zijn hoge haalbaarheid, lage kosten, snelle ontwikkeling, optische transparantie, en genetische instandhoudingen11,12. Een ander voordeel van de zebravis ten opzichte van het muismodel is de bevruchting van de viseieren ex utero, waardoor de embryo’s gedurende hun ontwikkeling kunnen worden gecontroleerd. Embryonale ontwikkeling is snel in zebravissen, en binnen 24 uur na de bemesting (hpf), de gewervelde lichaam vliegtuig heeft al gevormd13. Met 72 pk komen eieren uit het chorion en gaan ze van het embryonale naar het bakstadium. De transparantie van de zebravis, de Casper-stam in het bijzonder14, biedt een unieke kans om de migratie van kankercellen en hun erkenning en targeting door nanodeeltjes in een levend dier te visualiseren. Ten slotte ontwikkelen zebravissen hun aangeboren immuunsysteem met 48 pkf, waarbij het adaptieve immuunsysteem achterblijft en pas functioneel wordt na 28 dagen na de bemesting15. Deze tijdskloof is ideaal voor de transplantatie van verschillende soorten menselijke kankercellen in zebravisembryo’s zonder immuunafstotingen te ervaren.
Hier beschreven is een methode die gebruik maakt van de transparantie en snelle ontwikkeling van zebravissen om de erkenning en targeting van menselijke kankercellen door fluorescerende nanodeeltjes in vivo aan te tonen. In deze test werden menselijke baarmoederhalskankercellen (HeLa-cellen) genetisch gemanipuleerd om een rood fluorescerend eiwit uit te drukken geïnjecteerd in het gevasculariseerde gebied in de perivitellineholte van 48 hpf embryo’s. Na 20-24 uur hadden de HeLa cellen zich al verspreid over de embryo’s door de bloedsomloop van vissen. Embryo’s met schijnbare metastase werden microinjected met ~0.5 nL van een nanodeeltjesoplossing direct achter het oog, waar het rijke capillaire bed zich bevindt. Met behulp van deze techniek, de ultrabright fluorescerende silica nanodeeltjes kunnen richten HeLa cellen zo snel als 20-30 min postinjectie. Door zijn eenvoud en effectiviteit vertegenwoordigt de zebravis een robuust in vivo model om een verscheidenheid aan nanodeeltjes te testen op hun vermogen om specifieke kankercellen te targeten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de zebravis als een in vivo systeem om het vermogen van nanodeeltjes te testen om uitgezaaide menselijke kankercellen te herkennen en te targeten. Verschillende factoren kunnen van invloed zijn op de succesvolle uitvoering van de experimenten. Ten eerste moeten embryo’s volledig ontwikkeld worden met 48 pk. De juiste ontwikkelingsfase van de embryo’s stelt hen in staat om de transplantatie van menselijke kankercellen te verdragen en te overleven. Embryo’s jonger dan 48 pk he…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Mevrouw Kaylee Smith, Mevrouw Lauren Kwok, en de heer Alexander Floru voor het proeflezen van het manuscript. H.F. erkent steun van de NIH (CA134743 en CA215059), de American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) en de St. Baldrick’s Foundation. F.J.F.L. erkent een beurs van Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkent NSF-steun (subsidie CBET 1605405) en NIH R41AI142890.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Ricerca sul cancro. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
