In Vivo Ciblage des cellules cancéreuses humaines xénograftées avec des nanoparticules de silice fluorescente fonctionnelles chez le poisson zèbre
Summary
Décrit ici est une méthode pour utiliser des embryons de poisson zèbre pour étudier la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à cibler les cellules cancéreuses humaines in vivo. Cette méthode permet l’évaluation et la sélection de nanoparticules optimales pour les futurs essais chez les grands animaux et dans les essais cliniques.
Abstract
Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt dans le domaine de la nanomédecine. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour faire le pont entre la nanotechnologie et son application biomédicale. La souris représente le modèle animal traditionnel pour les essais précliniques; cependant, les souris sont relativement chères à garder et ont de longs cycles expérimentaux en raison de la descendance limitée de chaque mère. Le poisson zèbre est devenu un puissant système modèle de recherche développementale et biomédicale, y compris la recherche sur le cancer. En particulier, en raison de sa transparence optique et de son développement rapide, les embryons de poisson zèbre sont bien adaptés à la surveillance in vivo en temps réel du comportement des cellules cancéreuses et de leurs interactions avec leur microenvironnement. Cette méthode a été développée pour introduire séquentiellement les cellules cancéreuses humaines et les nanoparticules fonctionnalisées dans les embryons transparents de poisson zèbre Casper et surveiller la reconnaissance in vivo et le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules en temps réel. Ce protocole optimisé montre que les nanoparticules fluorescentes étiquetées, qui sont fonctionnalisées avec des groupes folates, peuvent reconnaître et cibler spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales humaines métastatiques étiquetées avec un fluorochrome différent. Le processus de reconnaissance et de ciblage peut se produire dès 30 min post-injection des nanoparticules testées. L’expérience ne nécessite que la reproduction de quelques couples de poissons adultes et prend moins de 4 jours pour terminer. En outre, les embryons de poisson zèbre n’ont pas un système immunitaire adaptatif fonctionnel, permettant l’engrafment d’un large éventail de cellules cancéreuses humaines. Par conséquent, l’utilité du protocole décrit ici permet de tester des nanoparticules sur différents types de cellules cancéreuses humaines, facilitant la sélection de nanoparticules optimales dans chaque contexte spécifique de cancer pour les tests futurs chez les mammifères et la clinique.
Introduction
Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt pour les physiciens et les chercheurs biomédicaux. L’émergence de la nanomédecine a conduit au développement de plusieurs nanoparticules, telles que celles conjuguées avec des ligands de ciblage et/ou des médicaments chimiothérapeutiques1,2,3. Les propriétés ajoutées des nanoparticules permettent leur interaction avec le système biologique, la détection et la surveillance des événements biologiques avec une grande efficacité et précision ainsi que des applications thérapeutiques. Les nanoparticules d’or et d’oxyde de fer sont principalement utilisées dans la tomographie calculée et les applications d’imagerie par résonance magnétique, respectivement. Alors que les activités enzymatiques des nanoparticules d’or et d’oxyde de fer permettent la détection des cellules cancéreuses par des tests colorimétriques, les nanoparticules fluorescentes sont bien adaptées aux applications d’imagerie in vivo4. Parmi eux, les nanoparticules fluorescentes ultrabright sont particulièrement bénéfiques, en raison de leur capacité à détecter les cancers tôt avec moins de particules et des toxicités réduites5.
Malgré ces avantages, les nanoparticules nécessitent des expérimentations à l’aide de modèles animaux in vivo pour la sélection de nanomatériaux appropriés et l’optimisation du processus de synthèse. En outre, tout comme les médicaments, les nanoparticules s’appuient sur des modèles animaux pour les tests précliniques afin de déterminer leur efficacité et leur toxicité. Le modèle préclinique le plus utilisé est la souris, qui est un mammifère dont l’entretien a un coût relativement élevé. Pour les études sur le cancer, les souris génétiquement modifiées ou les souris xénograftées sont généralement utilisées6,,7. La durée de ces expériences s’étend souvent de semaines à mois. En particulier, pour les études de métastases cancéreuses, les cellules cancéreuses sont directement injectées dans le système circulatoire des souris à des endroits tels que les veines de queue et les rates8,9,10. Ces modèles ne représentent les phases finales de la métastase que lorsque les cellules tumorales extravasent et colonisent des organes éloignés. En outre, en raison de problèmes de visibilité, il est particulièrement difficile de surveiller la migration des cellules tumorales et le ciblage des nanoparticules des cellules tumorales chez les souris.
Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système vertébré pour la recherche sur le cancer en raison de sa fécondité élevée, faible coût, développement rapide, transparence optique, et les conservations génétiques11,12. Un autre avantage du poisson zèbre sur le modèle de souris est la fertilisation des oeufs de poisson ex utero, qui permet aux embryons d’être surveillés tout au long de leur développement. Le développement embryonnaire est rapide chez le poisson zèbre, et dans les 24 heures postfertilisation (hpf), le plan du corps vertébré a déjà formé13. Par 72 hpf, les œufs sont éclos à partir du chorion, passant de l’embryon au stade des alevins. La transparence du poisson zèbre, la souche Casper en particulier14, offre une occasion unique de visualiser la migration des cellules cancéreuses et leur reconnaissance et leur ciblage par les nanoparticules chez un animal vivant. Enfin, le poisson zèbre développe son système immunitaire inné de 48 hpf, le système immunitaire adaptatif étant à la traîne et ne devenant fonctionnel qu’à 28 jours après la fertilisation15. Cet écart de temps est idéal pour la transplantation de divers types de cellules cancéreuses humaines dans des embryons de poisson zèbre sans éprouver de rejets immunitaires.
Décrit ici est une méthode qui tire parti de la transparence et le développement rapide du poisson zèbre pour démontrer la reconnaissance et le ciblage des cellules cancéreuses humaines par des nanoparticules fluorescentes in vivo. Dans ce test, les cellules cancéreuses du col de l’utérus humains (cellules HeLa) génétiquement modifiées pour exprimer une protéine fluorescente rouge ont été injectées dans la zone vascularisée dans la cavité périviseline de 48 embryons de hpf. Après 20-24 h, les cellules HeLa s’étaient déjà propagées à travers les embryons par le système circulatoire des poissons. Les embryons atteints de métastases apparentes ont été microinjectés avec ~0,5 nL d’une solution de nanoparticule directement derrière l’œil, où se trouve le riche lit capillaire. Grâce à cette technique, les nanoparticules fluorescentes ultrabright peuvent cibler les cellules HeLa aussi rapidement que 20-30 min post-injection. En raison de sa simplicité et de son efficacité, le poisson zèbre représente un modèle in vivo robuste pour tester une variété de nanoparticules pour leur capacité à cibler des cellules cancéreuses spécifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici utilise le poisson zèbre comme un système in vivo pour tester la capacité des nanoparticules à reconnaître et à cibler les cellules cancéreuses humaines métastatiques. Plusieurs facteurs peuvent avoir un impact sur l’exécution réussie des expériences. Tout d’abord, les embryons doivent être entièrement développés à 48 hpf. Le stade de développement correct des embryons leur permet de supporter et de survivre à la transplantation de cellules cancéreuses humaines. Les embryon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Kaylee Smith, Mme Lauren Kwok et M. Alexander Floru d’avoir relu le manuscrit. H.F. reconnaît le soutien des NIH (CA134743 et CA215059), de l’American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) et de la St. Baldrick’s Foundation. F.J.F.L. reconnaît une bourse du Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S reconnaît le soutien de la NSF (subvention CBET 1605405) et nih R41AI142890.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
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