In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen
Summary
Hier wird eine Methode beschrieben, mit der Zebrafischembryonen verwendet werden können, um die Fähigkeit funktionalisierter Nanopartikel zu untersuchen, menschliche Krebszellen in vivo anzugreifen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung und Auswahl optimaler Nanopartikel für zukünftige Tests bei Großen Tieren und in klinischen Studien.
Abstract
Die Entwicklung von Nanopartikeln, die Krebszellen erkennen, gezielt angreifen und zerstören können, ist auf dem Gebiet der Nanomedizin von großem Interesse. In vivo Tiermodelle sind erforderlich, um die Nanotechnologie mit ihrer biomedizinischen Anwendung zu überbrücken. Die Maus stellt das traditionelle Tiermodell für präklinische Tests dar; Mäuse sind jedoch relativ teuer zu halten und haben lange experimentelle Zyklen aufgrund der begrenzten Nachkommenschaft von jeder Mutter. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Entwicklungs- und Biomedizinische Forschung, einschließlich der Krebsforschung, entwickelt. Insbesondere aufgrund seiner optischen Transparenz und schnellen Entwicklung eignen sich Zebrafischembryonen gut für die Echtzeit-In-vivo-Überwachung des Verhaltens von Krebszellen und ihrer Wechselwirkungen mit ihrer Mikroumgebung. Diese Methode wurde entwickelt, um menschliche Krebszellen und funktionalisierte Nanopartikel sequenziell in transparente Casper-Zebrafisch-Embryonen einzuführen und die In-vivo-Erkennung und -Targeting der Krebszellen durch Nanopartikel in Echtzeit zu überwachen. Dieses optimierte Protokoll zeigt, dass fluoreszierend markierte Nanopartikel, die mit Folatgruppen funktionalisiert sind, metastasierende menschliche Gebärmutterhalsepithelkrebszellen, die mit einem anderen Fluorchrom gekennzeichnet sind, gezielt erkennen und zielen können. Der Erkennungs- und Targeting-Prozess kann bereits nach 30 min Nachinjektion der getesteten Nanopartikel erfolgen. Das ganze Experiment erfordert nur die Zucht von ein paar Paar enerwachsener Fische und dauert weniger als 4 Tage. Darüber hinaus fehlt Zebrafischembryonen ein funktionelles adaptives Immunsystem, das die Transplantation einer Vielzahl menschlicher Krebszellen ermöglicht. Daher ermöglicht der Nutzen des hier beschriebenen Protokolls die Erprobung von Nanopartikeln an verschiedenen Arten menschlicher Krebszellen, was die Auswahl optimaler Nanopartikel in jedem spezifischen Krebskontext für zukünftige Tests an Säugetieren und der Klinik erleichtert.
Introduction
Die Entwicklung von Nanopartikeln, die in der Lage sind, Krebszellen zu erkennen, gezielt zu zielen und zu zerstören, ist sowohl für Physiker als auch für biomedizinische Forscher von großem Interesse. Die Entstehung der Nanomedizin führte zur Entwicklung mehrerer Nanopartikel, z. B. solcher, die mit Zielliganden und/oder Chemotherapeutika1,2,3konjugiert wurden. Die zusätzlichen Eigenschaften von Nanopartikeln ermöglichen ihre Interaktion mit dem biologischen System, die Erfassung und Überwachung biologischer Ereignisse mit hoher Effizienz und Genauigkeit zusammen mit therapeutischen Anwendungen. Gold- und Eisenoxid-Nanopartikel werden hauptsächlich in DerComputertomographie bzw. Magnetresonanztomographie eingesetzt. Während die enzymatischen Aktivitäten von Gold- und Eisenoxid-Nanopartikeln den Nachweis von Krebszellen durch farbmetrische Assays ermöglichen, eignen sich fluoreszierende Nanopartikel gut für in vivo-Bildgebungsanwendungen4. Unter ihnen sind ultrahelle fluoreszierende Nanopartikel besonders vorteilhaft, da sie Krebs früh mit weniger Partikeln und reduzierter Toxizität erkennen können5.
Trotz dieser Vorteile müssen Nanopartikel mit in vivo Tiermodellen zur Auswahl geeigneter Nanomaterialien und zur Optimierung des Syntheseprozesses experimentiert werden. Darüber hinaus verlassen sich Nanopartikel, genau wie Medikamente, auf Tiermodelle für präklinische Tests, um ihre Wirksamkeit und Toxizität zu bestimmen. Das am weitesten verbreitete präklinische Modell ist die Maus, ein Säugetier, dessen Unterhalt relativ teuer ist. Für Krebsstudien werden in der Regel gentechnisch veränderte Mäuse oder xenografierte Mäuse in der Regel6,7verwendet. Die Dauer dieser Experimente erstreckt sich oft von Wochen bis Monaten. Insbesondere für Krebsmetastasenstudien werden Krebszellen direkt in das Kreislaufsystem der Mäuse an Orten wie Schwanzvenen und Milz8,,9,10injiziert. Diese Modelle stellen nur die Endstadien der Metastasierung dar, wenn Tumorzellen entfernte Organe extravasieren und besiedeln. Darüber hinaus ist es aufgrund von Sichtbarkeitsproblemen besonders schwierig, die Tumorzellmigration und das Nanopartikel-Targeting von Tumorzellen bei Mäusen zu überwachen.
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem leistungsfähigen Wirbeltiersystem für die Krebsforschung aufgrund seiner hohen Fruchtbarkeit, niedrigen Kosten, schnelle Entwicklung, optische Transparenz und genetische Konservierung11,12. Ein weiterer Vorteil des Zebrafisches gegenüber dem Mausmodell ist die Befruchtung der Fischeier ex utero, wodurch die Embryonen während ihrer entwicklung überwacht werden können. Die embryonale Entwicklung ist bei Zebrafischen schnell, und innerhalb von 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) hat sich die Wirbeltierkörperebene bereits13gebildet. Bei 72 hpf werden die Eier aus dem Chorgezelt geschlüpft und gehen vom embryonalen zum Bratenstadium über. Die Transparenz des Zebrafisches, insbesondere des Casper-Stamms 14, bietet eine einzigartige Gelegenheit, die Migration von Krebszellen und deren Erkennung und Ausrichtung durch Nanopartikel bei einem lebenden Tier zu visualisieren. Schließlich entwickeln Zebrafische ihr angeborenes Immunsystem um 48 hpf, wobei das adaptive Immunsystem hinterherhinkt und erst nach 28 Tagen nach der Befruchtung15funktionsfähig wird. Diese Zeitlücke ist ideal für die Transplantation verschiedener Arten menschlicher Krebszellen in Zebrafischembryonen ohne Immunabstoßung.
Hier wird eine Methode beschrieben, die die Transparenz und schnelle Entwicklung von Zebrafischen nutzt, um die Erkennung und Ausrichtung menschlicher Krebszellen durch fluoreszierende Nanopartikel in vivo zu demonstrieren. In diesem Test wurden menschliche Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen), die gentechnisch verändert wurden, um ein rotes fluoreszierendes Protein auszudrücken, in den vaskularisierten Bereich in der Perivitellinehöhle von 48-hpf-Embryonen injiziert. Nach 20-24 h hatten sich die HeLa-Zellen bereits über das Fischkreislaufsystem in den Embryonen ausgebreitet. Embryonen mit scheinbarer Metastasierung wurden mit 0,5 nL einer Nanopartikellösung direkt hinter dem Auge mikroinjiziert, wo sich das reichhaltige Kapillarbett befindet. Mit dieser Technik können die ultrahellen fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikel bis nach der Injektion von 20-30 min auf HeLa-Zellen abzielen. Aufgrund seiner Einfachheit und Wirksamkeit stellt der Zebrafisch ein robustes In-vivo-Modell dar, um eine Vielzahl von Nanopartikeln auf ihre Fähigkeit zu testen, bestimmte Krebszellen anzusprechen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll nutzt den Zebrafisch als In-vivo-System, um die Fähigkeit von Nanopartikeln zu testen, metastasierende menschliche Krebszellen zu erkennen und zu zielen. Mehrere Faktoren können die erfolgreiche Durchführung der Experimente beeinflussen. Zunächst müssen Embryonen mit 48 hpf vollständig entwickelt werden. Das richtige Entwicklungsstadium der Embryonen ermöglicht es ihnen, die Transplantation menschlicher Krebszellen zu überstehen und zu überleben. Embryonen unter 48 hpf haben eine …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Frau Kaylee Smith, Frau Lauren Kwok und Herrn Alexander Floru für das Korrekturlesen des Manuskripts. H.F. unterstützt die NIH (CA134743 und CA215059), die American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) und die St. Baldrick es Foundation. F.J.F.L. bestätigt ein Stipendium des Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkennt NSF-Unterstützung (Grant CBET 1605405) und NIH R41AI142890 an.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
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