वीवो में ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ Xenografted मानव कैंसर कोशिकाओं का लक्ष्यीकरण
Summary
यहां वर्णित वीवो में मानव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए कार्यात्मक नैनोकणों की क्षमता का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण का उपयोग करने के लिए एक विधि है । यह विधि बड़े जानवरों और नैदानिक परीक्षणों में भविष्य के परीक्षण के लिए इष्टतम नैनोकणों के मूल्यांकन और चयन के लिए अनुमति देती है।
Abstract
नैनोमेडिसिन के क्षेत्र में कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने, लक्षित करने और नष्ट करने में सक्षम नैनोकणों का विकास करना बहुत रुचि रखता है। वीवो पशु मॉडल में नैनो को इसके बायोमेडिकल एप्लीकेशन में पाटने के लिए आवश्यक हैं। माउस प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए पारंपरिक पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है; हालांकि, चूहों को रखने के लिए अपेक्षाकृत महंगा है और प्रत्येक मां से सीमित संतान के कारण लंबे समय तक प्रयोगात्मक चक्र हैं। जेब्राफिश कैंसर रिसर्च सहित विकासात्मक और बायोमेडिकल रिसर्च के लिए एक शक्तिशाली मॉडल सिस्टम के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता और तेजी से विकास के कारण, जेब्राफिश भ्रूण कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार और उनके माइक्रोएनवायरमेंट के साथ उनकी बातचीत की वीवो निगरानी में वास्तविक समय के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। इस विधि को क्रमिक रूप से मानव कैंसर कोशिकाओं को पेश करने और पारदर्शी कैस्पर जेब्राफिश भ्रूण में कार्यात्मक नैनोकणों को पेश करने और वास्तविक समय में नैनोकणों द्वारा कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने और वीवो मान्यता में निगरानी करने के लिए विकसित किया गया था। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल से पता चलता है कि फ्लोरोसेंटली लेबल नैनोकण, जो फोलेट समूहों के साथ कार्यात्मक हैं, विशेष रूप से मेटास्टैटिक मानव सर्वाइकल एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं को एक अलग फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल कर सकते हैं। मान्यता और लक्ष्यीकरण प्रक्रिया नैनोकणों के परीक्षण के 30 मिनट के बाद के रूप में जल्दी हो सकती है। पूरे प्रयोग के लिए केवल वयस्क मछली के कुछ जोड़े के प्रजनन की आवश्यकता होती है और इसे पूरा करने में 4 दिन से भी कम समय लगता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में एक कार्यात्मक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है, जिससे मानव कैंसर कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की एनग्रफ्टमेंट की अनुमति होती है। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल की उपयोगिता विभिन्न प्रकार की मानव कैंसर कोशिकाओं पर नैनोकणों के परीक्षण को सक्षम बनाती है, जिससे स्तनधारियों और क्लिनिक में भविष्य के परीक्षण के लिए प्रत्येक विशिष्ट कैंसर संदर्भ में इष्टतम नैनोकणों के चयन की सुविधा मिलती है ।
Introduction
नैनोकणों का विकास जो कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने, लक्षित करने और नष्ट करने में सक्षम हैं, भौतिकविदों और जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं दोनों के लिए बहुत रुचि रखते हैं। नैनोमेडिसिन के उद्भव से कई नैनोकणों का विकास हुआ, जैसे कि लिगांड और/या कीमोथेमोटिक दवाओं को लक्षित करने के साथ संयुग्मित1,,2,,3। नैनोकणों के जोड़े गए गुण जैविक प्रणाली के साथ उनकी बातचीत को सक्षम करते हैं, चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ उच्च दक्षता और सटीकता के साथ जैविक घटनाओं को संवेदन और निगरानी करते हैं। सोने और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग मुख्य रूप से क्रमशः गणना टोमोग्राफी और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग अनुप्रयोगों में किया जाता है। जबकि सोने और आयरन ऑक्साइड नैनोकणों की एंजाइमेटिक गतिविधियां कोलोरिमेट्रिक परख के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देती हैं, फ्लोरोसेंट नैनोकण वीवो इमेजिंग अनुप्रयोगों 4 में अच्छीतरहसे अनुकूल हैं। उनमें से, अल्ट्राब्राइट फ्लोरोसेंट नैनोकण विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं, उनके कम कणों और कम विषाक्तता5के साथ जल्दी कैंसर का पता लगाने की क्षमता के कारण।
इन फायदों के बावजूद, नैनोकणों को उपयुक्त नैनोमैटेरियल्स के चयन और संश्लेषण प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए वीवो पशु मॉडल में उपयोग करके प्रयोग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, दवाओं की तरह, नैनोकण अपनी प्रभावकारिता और विषाक्तता निर्धारित करने के लिए प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया preclinical मॉडल माउस है, जो एक स्तनपायी जिसका रखरखाव एक अपेक्षाकृत उच्च लागत पर आता है । कैंसर के अध्ययन के लिए, या तो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों या ज़ेनोबेड़ा चूहों का उपयोग आमतौर पर6, 7,कियाजाताहै। इन प्रयोगों की लंबाई अक्सर हफ्तों से महीनों तक फैली होती है। विशेष रूप से, कैंसर मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए, कैंसर कोशिकाओं को सीधे पूंछ नसों और,तिल्ली8,9,10जैसे स्थानों पर चूहों की संचार प्रणाली में इंजेक्ट किया जाता है।, ये मॉडल केवल मेटास्टेसिस के अंतिम चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जब ट्यूमर कोशिकाएं दूर के अंगों को असाधारण और उपनिवेश करती हैं। इसके अलावा, दृश्यता के मुद्दों के कारण, चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के ट्यूमर सेल माइग्रेशन और नैनोपार्टिकल को लक्षित करने की निगरानी करना विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है।
जेब्राफिश(दानियो रेरियो)अपनी उच्च fecundity, कम लागत, तेजी से विकास, ऑप्टिकल पारदर्शिता, और आनुवंशिक संरक्षण11, 12,12के कारण कैंसर अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी प्रणाली बन गया है । माउस मॉडल पर ज़ेब्राफ़िश का एक और लाभ मछली के अंडे पूर्व गर्भाशय का निषेचन है, जो भ्रूण को उनके पूरे विकास में निगरानी करने की अनुमति देता है। जेब्राफिश में भ्रूणीय विकास तेजी से होता है, और 24 घंटे के भीतर पोस्टफर्टिलाइजेशन (एचपीएफ), कशेरुकी शरीर विमान पहले ही13बना चुका है। 72 एचपीएफ तक, अंडे कोरियोन से रची जाती हैं, जो भ्रूण से फ्राई स्टेज में संक्रमण करते हैं। जेब्राफिश की पारदर्शिता, विशेष रूप से14में कैस्पर तनाव, कैंसर कोशिकाओं के प्रवास और उनकी मान्यता और एक जीवित जानवर में नैनोकणों द्वारा लक्षित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। अंत में, ज़ेब्राफ़िश 48 एचपीएफ द्वारा अपनी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित करता है, जिसमें अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली पिछड़ जाती है और केवल 28 दिनों के बाद15पर कार्यात्मक हो जाती है। इस समय अंतर प्रतिरक्षा अस्वीकृति का अनुभव किए बिना जेब्राफिश भ्रूण में मानव कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के प्रत्यारोपण के लिए आदर्श है।
यहां वर्णित एक तरीका है जो वीवो में फ्लोरोसेंट नैनोकणों द्वारा मानव कैंसर कोशिकाओं की मान्यता और लक्ष्यीकरण को प्रदर्शित करने के लिए जेब्राफिश की पारदर्शिता और तेजी से विकास का लाभ उठाता है। इस परख में, मानव गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं (HeLa कोशिकाओं) आनुवंशिक रूप से एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर ४८ hpf भ्रूण के पेरिविटेलिन गुहा में संवहनी क्षेत्र में इंजेक्शन थे । 20-24 घंटे के बाद, HeLa कोशिकाओं को पहले से ही मछली संचार प्रणाली के माध्यम से भ्रूण भर में फैल गया था । स्पष्ट मेटास्टेसिस वाले भ्रूण सीधे आंख के पीछे नैनोपार्टिकल समाधान के ~ 0.5 एन एल के साथ माइक्रोइंटेक्टेड थे, जहां समृद्ध केशिका बिस्तर स्थित है। इस तकनीक का उपयोग करके, अल्ट्राब्राइट फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों 20-30 मिनट के बाद के रूप में जल्दी के रूप में हेला कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं । अपनी सादगी और प्रभावशीलता के कारण, ज़ेब्राफिश विशिष्ट कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने की क्षमता के लिए विभिन्न नैनोकणों का परीक्षण करने के लिए वीवो मॉडल में एक मजबूत का प्रतिनिधित्व करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल मेटास्टैटिक मानव कैंसर कोशिकाओं को पहचानने और लक्षित करने के लिए नैनोकणों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए वीवो प्रणाली में जेब्राफिश का उपयोग करता है। कई कारक प्रयोगों के सफल ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए सुश्री कायली स्मिथ, सुश्री लॉरेन क्वोक और श्री अलेक्जेंडर फ्लोरू का शुक्रिया अदा करते हैं । एचएफ एनआईएच (CA134743 और CA215059), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (आरएसजी-17-204 01-TBG), और सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन से अनुदान समर्थन स्वीकार करते हैं । F.J.F.L. बोस्टन विश्वविद्यालय नवाचार केंद्र से एक फैलोशिप स्वीकार-BUnano पार-कैंसर के लिए नैनो में अनुशासनात्मक प्रशिक्षण (XTNC) । आई एस एनएसएफ समर्थन (अनुदान CBET 1605405) और NIH R41AI142890 स्वीकार करते हैं।
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
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