In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish
Summary
Descrito aquí es un método para utilizar embriones de pez cebra para estudiar la capacidad de las nanopartículas funcionalizadas para atacar las células cancerosas humanas in vivo. Este método permite la evaluación y selección de nanopartículas óptimas para futuras pruebas en animales grandes y en ensayos clínicos.
Abstract
Desarrollar nanopartículas capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés en el campo de la nanomedicina. Los modelos animales in vivo son necesarios para unir la nanotecnología a su aplicación biomédica. El ratón representa el modelo animal tradicional para las pruebas preclínicas; sin embargo, los ratones son relativamente caros de mantener y tienen ciclos experimentales largos debido a la limitada progenie de cada madre. El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para la investigación del desarrollo y la biomédica, incluida la investigación del cáncer. En particular, debido a su transparencia óptica y rápido desarrollo, los embriones de pez cebra son muy adecuados para el monitoreo in vivo en tiempo real del comportamiento de las células cancerosas y sus interacciones con su microambiente. Este método fue desarrollado para introducir secuencialmente células cancerosas humanas y nanopartículas funcionalizadas en embriones transparentes de pez cebra Casper y monitorear el reconocimiento in vivo y la focalización de las células cancerosas por nanopartículas en tiempo real. Este protocolo optimizado muestra que las nanopartículas con etiqueta fluorescente, que están funcionalizadas con grupos de folatos, pueden reconocer y atacar específicamente las células de cáncer epiteliales humanos metastásicos etiquetadas con un fluorocromo diferente. El proceso de reconocimiento y focalización puede ocurrir tan pronto como 30 min postinjection de las nanopartículas probadas. Todo el experimento sólo requiere la cría de unos pocos pares de peces adultos y tarda menos de 4 días en completarse. Además, los embriones de pez cebra carecen de un sistema inmunitario adaptativo funcional, lo que permite el injerto de una amplia gama de células cancerosas humanas. Por lo tanto, la utilidad del protocolo descrito aquí permite la prueba de nanopartículas en varios tipos de células cancerosas humanas, facilitando la selección de nanopartículas óptimas en cada contexto específico del cáncer para futuras pruebas en mamíferos y la clínica.
Introduction
El desarrollo de nanopartículas que son capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés tanto para los físicos como para los investigadores biomédicos. La aparición de nanomedicina condujo al desarrollo de varias nanopartículas, como las conjugadas con ligandos de orientación y/o fármacos quimioterápicos1,,2,,3. Las propiedades añadidas de las nanopartículas permiten su interacción con el sistema biológico, la detección y el seguimiento de eventos biológicos con alta eficiencia y precisión junto con aplicaciones terapéuticas. Las nanopartículas de oro y óxido de hierro se utilizan principalmente en aplicaciones de tomografía computarizada y resonancia magnética, respectivamente. Mientras que las actividades enzimáticas de las nanopartículas de oro y óxido de hierro permiten la detección de células cancerosas a través de ensayos colorimétricos, las nanopartículas fluorescentes son adecuadas para aplicaciones de imágenes in vivo4. Entre ellas, las nanopartículas fluorescentes ultrabright son particularmente beneficiosas, debido a su capacidad para detectar cánceres a tiempo con menos partículas y toxicidades reducidas5.
A pesar de estas ventajas, las nanopartículas requieren experimentación utilizando modelos animales in vivo para la selección de nanomateriales adecuados y la optimización del proceso de síntesis. Además, al igual que los medicamentos, las nanopartículas se basan en modelos animales para pruebas preclínicas para determinar su eficacia y toxicidades. El modelo preclínico más utilizado es el ratón, que es un mamífero cuyo mantenimiento tiene un costo relativamente alto. Para los estudios de cáncer, ya sea ratones genéticamente diseñados o ratones xenoinjertados se utilizan típicamente6,7. La duración de estos experimentos a menudo abarca de semanas a meses. En particular, para los estudios de metástasis del cáncer, las células cancerosas se inyectan directamente en el sistema circulatorio de los ratones en lugares como las venas de cola y el bazo8,,9,10. Estos modelos sólo representan las etapas finales de la metástasis cuando las células tumorales extravasan y colonizan órganos distantes. Además, debido a problemas de visibilidad, es particularmente difícil monitorear la migración de células tumorales y la focalización de nanopartículas de las células tumorales en ratones.
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un potente sistema de vertebrados para la investigación del cáncer debido a su alta fecundidad, bajo costo, desarrollo rápido, transparencia óptica, y conservaciones genéticas11,12. Otra ventaja del pez cebra sobre el modelo de ratón es la fertilización de los huevos de pescado ex utero, que permite controlar los embriones durante todo su desarrollo. El desarrollo embrionario es rápido en el pez cebra, y dentro de las 24 horas de postfertilización (hpf), el plano del cuerpo vertebrado ya ha formado13. A los 72 hpf, los huevos son incubados de la coral, pasando de la etapa embrionaria a la etapa de alevines. La transparencia del pez cebra, la cepa Casper en particular14, ofrece una oportunidad única para visualizar la migración de las células cancerosas y su reconocimiento y focalización por nanopartículas en un animal vivo. Finalmente, el pez cebra desarrolla su sistema inmunológico innato en 48 hpf, con el sistema inmune adaptativo rezagado y sólo se vuelve funcional a los 28 días de postfertilización15. Esta brecha de tiempo es ideal para el trasplante de varios tipos de células cancerosas humanas en embriones de pez cebra sin experimentar rechazos inmunes.
Aquí se describe un método que aprovecha la transparencia y el rápido desarrollo del pez cebra para demostrar el reconocimiento y la focalización de las células cancerosas humanas mediante nanopartículas fluorescentes in vivo. En este ensayo, se inyectaron células de cáncer de cuello uterino humano (células HeLa) genéticamente diseñadas para expresar una proteína fluorescente roja en el área vascularizada en la cavidad perivitellina de 48 hpf embriones. Después de 20-24 h, las células de HeLa ya se habían diseminado por los embriones a través del sistema circulatorio de peces. Los embriones con metástasis aparente se inyectaron microincisiones con 0,5 nL de una solución de nanopartículas directamente detrás del ojo, donde se encuentra el rico lecho capilar. Usando esta técnica, las nanopartículas fluorescentes ultrabright de sílice pueden apuntar a las células de HeLa tan rápido como 20-30 min postinjection. Debido a su simplicidad y eficacia, el pez cebra representa un modelo in vivo robusto para probar una variedad de nanopartículas por su capacidad para atacar células cancerosas específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí utiliza el pez cebra como un sistema in vivo para probar la capacidad de las nanopartículas para reconocer y atacar las células de cáncer humano metastásicas. Varios factores pueden afectar a la ejecución exitosa de los experimentos. En primer lugar, los embriones deben desarrollarse completamente a 48 cvf. La correcta etapa de desarrollo de los embriones les permite soportar y sobrevivir al trasplante de células cancerosas humanas. Los embriones menores de 48 hpf tienen una tasa de supe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Sra. Kaylee Smith, a la Sra. Lauren Kwok y al Sr. Alexander Floru por revisar el manuscrito. H.F. reconoce el apoyo otorgado por el NIH (CA134743 y CA215059), la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-17-204 01-TBG) y la Fundación St. Baldrick. F.J.F.L. reconoce una beca del Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S reconoce la ayuda NSF (concesión CBET 1605405) y NIH R41AI142890.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
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