Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde
Summary
Burada açıklanan vivo insan kanser hücrelerini hedef işlevsel nano tanecikleri yeteneğini incelemek için zebra balığı embriyoları kullanmak için bir yöntemdir. Bu yöntem, büyük hayvanlarda ve klinik çalışmalarda gelecekteki testler için optimal nano partiküllerin değerlendirilmesi ve seçilmesi için izin verir.
Abstract
Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi nanotıp alanında büyük ilgi görüyor. In vivo hayvan modelleri biyomedikal uygulama için nanoteknoloji köprü için gereklidir. Fare preklinik test için geleneksel hayvan modeli temsil eder; ancak, fareler tutmak için nispeten pahalı ve her anneden sınırlı döl nedeniyle uzun deneysel döngüleri var. Zebra balığı kanser araştırmaları da dahil olmak üzere gelişimsel ve biyomedikal araştırmalar için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, optik şeffaflık ve hızlı gelişimi nedeniyle, zebra balığı embriyoları iyi kanser hücrelerinin davranışı ve mikro çevre ile etkileşimleri gerçek zamanlı in vivo izleme için uygundur. Bu yöntem, şeffaf Casper zebra balığı embriyolarında insan kanser hücrelerini ve fonksiyonel nano partiküllerini sırayla tanıtmak ve kanser hücrelerinin gerçek zamanlı olarak nano partiküller tarafından in vivo tanıma ve hedeflemesini izlemek için geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş protokol, folat grupları ile işlevsel hale getirilmiş floresan etiketli nano taneciklerin, farklı bir florokrom ile etiketlenmiş metastatik insan servikal epitel kanseri hücrelerini özellikle tanıyıp hedefleyebildiğini göstermektedir. Tanıma ve hedefleme işlemi test edilen nano partiküllerin 30 dk sonrası enjeksiyonu kadar erken bir sürede gerçekleşebilir. Tüm deney sadece yetişkin balık birkaç çift üreme gerektirir ve tamamlamak için 4 günden az sürer. Ayrıca, zebra balığı embriyoları fonksiyonel bir adaptif bağışıklık sistemi eksikliği, insan kanser hücrelerinin geniş bir yelpazede engraftment izin. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün yararı insan kanser hücrelerinin çeşitli nano tanecikleri test sağlar, memeliler ve klinikte gelecekteki test için her özel kanser bağlamında optimal nano tanecikleri seçimi kolaylaştıran.
Introduction
Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi hem fizikçiler hem de biyomedikal araştırmacılar için büyük ilgi çekicidir. Nanotıp ortaya çıkması çeşitli nano tanecikleri gelişmesine yol açtı, bu ligands ve / veya kemoterapötikilaçlar1 hedefleme ile konjuge gibi1 ,2,3. Nano partiküllerin eklenen özellikleri, biyolojik sistemle etkileşimlerini, biyolojik olayları yüksek verimlilik ve doğrulukla algılamalarını ve izlemelerini ve terapötik uygulamaları sağlarlar. Altın ve demir oksit nano partikülleri öncelikle bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme uygulamalarında sırasıyla kullanılır. Altın ve demir oksit nano tanecikleri enzimatik faaliyetleri kolorimetrik tahliller yoluyla kanser hücrelerinin tespiti ne izin, floresan nano tanecikleri de in vivo görüntüleme uygulamaları için uygundur4. Bunlar arasında, ultraparlak floresan nano tanecikleri özellikle yararlıdır, daha az parçacıklar ve azaltılmış toksisite ile erken kanserleri tespit etme yetenekleri nedeniyle5.
Bu avantajlara rağmen nano partiküller uygun nanomalzemelerin seçimi ve sentez sürecinin optimizasyonu için in vivo hayvan modellerini kullanarak deney gerektirir. Ayrıca, tıpkı ilaçlar gibi, nano tanecikleri etkinliğini ve toksisite belirlemek için preklinik test için hayvan modelleri güveniyor. En yaygın olarak kullanılan preklinik model fare, olan bakım nispeten yüksek bir maliyetle gelen bir memeli. Kanser çalışmaları için, ya genetiği değiştirilmiş fareler veya ksenogreftli fareler genelliklekullanılır 6,7. Bu deneylerin uzunluğu genellikle haftalar cakadar uzanır. Özellikle, kanser metastazı çalışmaları için, kanser hücreleri doğrudan kuyruk damarları ve dalak 8 gibi yerlerde farelerin dolaşım sistemine enjekte edilir8,9,10. Bu modeller sadece tümör hücreleri ekstravaze ve uzak organları kolonize metastaz son aşamalarını temsil eder. Ayrıca, görünürlük sorunları nedeniyle, özellikle farelerde tümör hücrelerinin tümör hücre göçü ve nanopartikül hedefleme izlemek zordur.
Zebra balığı(Danio rerio)yüksek fecundity nedeniyle kanser araştırmaları için güçlü bir omurgalı sistemi haline gelmiştir, düşük maliyetli, hızlı gelişme, optik şeffaflık, ve genetik korumaları11,12. Fare modeli üzerinde zebra balığı bir diğer avantajı balık yumurtaları ex utero döllenme, hangi embriyoların gelişimi boyunca izlenmesini sağlar. Embriyonik gelişim zebra balığında hızlıdır ve 24 saat sonrası döllenme (hpf) içinde omurgalı vücut düzlemi zaten13. 72 hpf ile, yumurta koro yumurtadan, kızartma aşamasına embriyonik geçiş. Zebra balığının şeffaflığı, özellikle Casper suşu14,kanser hücrelerinin göç ve tanıma ve canlı bir hayvan nano tanecikleri tarafından hedefleme görselleştirmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Son olarak, zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemini geliştirmek 48 hpf, adaptif bağışıklık sistemi geride kalan ve sadece fonksiyonel hale ile 28 gün postfertilizasyon15. Bu zaman farkı, bağışıklık reddi yaşamadan zebra balığı embriyolarına insan kanser hücrelerinin çeşitli nakli için idealdir.
Burada açıklanan şeffaflık ve canlı floresan nano tanecikleri tarafından insan kanser hücrelerinin tanınması ve hedefolduğunu göstermek için zebra balığı hızlı gelişimi yararlanan bir yöntemdir. Bu araştırmada, kırmızı floresan proteini ifade etmek için genetik olarak tasarlanmış insan servikal kanser hücreleri (HeLa hücreleri) 48 hpf embriyonun perivitellin boşluğundaki vaskülar bölgeye enjekte edildi. 20-24 saat sonra, HeLa hücreleri zaten balık dolaşım sistemi yoluyla embriyolar boyunca yayılmıştı. Belirgin metastazı olan embriyolara, zengin kılcal yatağın bulunduğu gözün hemen arkasında ~0.5 nL’lik bir nanopartikül çözeltisi enjekte edildi. Bu tekniği kullanarak, ultraparlak floresan silika nano tanecikleri 20-30 dk enjeksiyon sonrası hızlı bir şekilde HeLa hücrelerini hedefleyebilir. Sadeliği ve etkinliği nedeniyle, zebra balığı belirli kanser hücrelerini hedef yetenekleri için nano tanecikleri çeşitli test etmek için sağlam bir in vivo modeli temsil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, nano partiküllerin metastatik insan kanser hücrelerini tanıma ve hedefleme yeteneğini test etmek için in vivo bir sistem olarak zebra balığı kullanır. Çeşitli etkenler deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyebilir. İlk olarak, embriyoların tam olarak 48 hpf geliştirilmiş olması gerekir. Embriyoların doğru gelişim evresi, insan kanser hücrelerinin nakline dayanmalarını ve hayatta kalmalarını sağlar. 48 hpf’den küçük embriyolar, daha yaşlı ve d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Bayan Kaylee Smith, Bayan Lauren Kwok ve Bay Alexander Floru’ya taslağı okudukleri için teşekkür eder. H.F. NIH (CA134743 ve CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) ve St. Baldrick Vakfı’ndan hibe desteği kabul eder. F.J.F.L. Boston Üniversitesi İnovasyon Merkezi-BUnano Çapraz Disiplin Eğitimi Kanser için Nanoteknoloji (XTNC) bir burs kabul eder. I.S, NSF desteğini (cbet 1605405 hibe) ve NIH R41AI142890’ı kabul eder.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
Riferimenti
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Ricerca sul cancro. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
