使用光可转换的登德拉2，在老化的蛋白质周转量中，在体内C.Elegans
Summary
这里介绍的是一个协议，用于监测蛋白质亨廷顿蛋白的降解，该蛋白与光可转换的荧光素Dendra2有关。
Abstract
蛋白质在细胞内不断合成和降解，以保持平衡。能够监测感兴趣的蛋白质的降解，不仅是了解其生命周期的关键，也是发现蛋白质组网络中的不平衡的关键。此方法演示如何跟踪致病蛋白亨廷顿蛋白的降解。与Dendra2融合的两种亨廷顿蛋白在C.elegans神经系统中表达：一种是生理版本，另一种是含有扩大和致病性的谷氨酰胺。Dendra2是一种光可转换荧光蛋白;在短的紫外线（UV）辐照脉冲下，Dendra2将其激发/发射光谱从绿色切换为红色。与脉冲追逐实验类似，可以监控和量化转换红-Dendra2的周转率，而不管新合成的 green-Dendra2 的干扰。使用基于共体显微镜的，由于C.elegans的光学透明度，可以监测和量化亨廷顿-Dendra2在活体，老化的生物体的降解。神经元亨廷顿蛋白-Dendra2在转换后很快部分退化，并随着时间的推移进一步清除。控制降解的系统缺乏突变亨廷顿蛋白的存在，并且随着老化而进一步受损。同一神经系统内的神经元亚型表现出不同的转液能力，用于亨廷顿-登德拉2。总体而言，监测与Dendra2融合的任何感兴趣的蛋白质，不仅可以提供重要信息，包括其降解和所涉及的蛋白酶网络的玩家，而且可提供有关其位置、贩运和运输的重要信息。
Introduction
生物体的蛋白质组在不断更新。蛋白质根据细胞的生理需求不断降解和合成。一些蛋白质很快被消除，而另一些则寿命更长。使用基因编码的荧光蛋白 （FPs） 时，监测蛋白质动力学是一项更简单、更准确、侵入性更小的任务。FPs以自动催化形式形成，可以融合到任何感兴趣的蛋白质（POI），但不需要酶折叠或需要辅助因子，但氧气1。新一代 FP 最近被设计为在照射时使用确定波长的光脉冲切换颜色。这些光激活的FP（PAFP）允许标记和跟踪POIS，或他们居住的细胞器或细胞，并检查其定量和/或定性参数2。FPs 能够跟踪任何 POI 的移动、方向性、运动速率、扩散系数、移动分数与移动分数、它驻留在一个蜂窝隔间中的时间以及其周转率。对于特定的细胞器，运动和运输，或裂变和融合事件可以确定。对于特定的单元格类型，可以建立单元格的位置、分割速率、体积和形状。至关重要的是，PAFP 的使用允许无需连续可视化，也无需任何新合成探头的干扰即可进行跟踪。细胞和整个生物体的研究已经成功地使用PAFP来解决体内的生物问题，如癌症和转移的发展，细胞骨架的组装或分解，以及RNA-DNA/蛋白质相互作用3。在这份手稿中，光显微镜和PAFP用于在神经退行性疾病的C.elegans模型中发现体内容易聚集的蛋白质亨廷顿蛋白（HTT）的周转率。
此处描述的协议量化了融合蛋白亨廷顿蛋白（HTT-D2）的稳定性和降解性。Dendra2 是第二代单体 PAFP4，它不可逆转地将其发射/激发光谱从绿色切换到红色，以响应紫外线或可见蓝光，其强度增加高达 4，000 倍5，,6。亨廷顿是导致亨廷顿舞蹈症（HD）的蛋白质，这是一种致命的遗传性神经退行性疾病。亨廷顿-1含有一段谷氨酰胺（CAG，Q）。当蛋白质以超过39Q表达时，它误入突变、有毒和致病性蛋白质。突变HTT容易聚集，导致神经元细胞死亡和退化，无论是短寡聚物种或较大的高度结构化淀粉样体7。
线虫是研究衰老和神经退化的模型系统，由于其操作方便性、等基因性、寿命短和光学透明度8。为了研究HTT体内的稳定性，在C.elegans的神经系统中表达了一种融合结构。HTT-D2 转基因含有 25Qs （HTTQ25-D2） 或 97Qs （HTTQ97-D2） 的病理拉伸，在整个线虫的生命周期9中，泛神经表达过度。通过将实时C. elegans接受简短且聚焦的光点，单个神经元被拍照切换，并随着时间的推移跟踪转换的 HTT-D2。为了确定HTT-D2的降解量，将刚转换的HTT-D2的红色信号与确定一段时间后HTT-D2的剩余红色信号进行比较。因此，与生理形态相比，发现亨廷顿蛋白的膨胀和毒性形式时，可以研究亨廷顿素是如何降解的;前神经元或后神经元对Q97与Q25的存在的反应如何不同，尤其是在较长的时间段内;以及蛋白质组菌网络 （PN） 在老化期间的崩溃如何导致降解率的差异。这些结果只描述了一组关于HTT-D2周转率的少量观测结果。然而，与蛋白质聚集和蛋白质结合领域相关的更多生物学问题可以通过这种体内应用加以解决。
Protocol
Representative Results
Discussion
要理解蛋白质的功能，了解其合成、位置和降解非常重要。随着新型、稳定、明亮的 FP 的发展，可视化和监控 POIs 变得更加简单和高效。基因表达聚变PAFP，如Dendra2具有独特的定位，可以研究POI的稳定性。当暴露在紫蓝色光下时，Dendra2在保存的氨基酸三合体内的精确位置断裂。荧光团经历了一个小的结构变化，导致光谱从绿色到红色23的完全转移。这种转变允许检测和监测与Dend…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢DFG（KI-1988/5-1到JK，神经库博士奖学金由神经治疗卓越集群到M MLP）的资金。我们还感谢柏林莱布尼茨分子药理学研究所（FMP）的成像核心设施提供成像设置。此外，我们要感谢迪奥戈·费莱西亚诺，他建立了Dendra2系统，并提供了指导。
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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