En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento C. Elegans usando Dendra fotoconvertible2
Summary
Aquí se presenta un protocolo para monitorear la degradación de la proteína huntingtina fusionada con el fluoróforo fotoconvertible Dendra2.
Abstract
Las proteínas se sintetizan y degradan constantemente dentro de una célula para mantener la homeostasis. Ser capaz de monitorear la degradación de una proteína de interés es clave para entender no sólo su ciclo de vida, sino también para descubrir desequilibrios en la red de proteostasis. Este método muestra cómo rastrear la degradación de la huntingtina de proteína causante de la enfermedad. Dos versiones de huntingtina fusionadas con Dendra2 se expresan en el sistema nervioso C. elegans: una versión fisiológica o una con un tramo expandido y patógeno de glutaminas. Dendra2 es una proteína fluorescente fotoconvertible; tras un corto pulso de irradiación ultravioleta (UV), Dendra2 cambia sus espectros de excitación/emisión de verde a rojo. Al igual que un experimento de persecución de pulsos, el volumen de negocios del rojo-Dendra2 convertido puede ser monitoreado y cuantificado, independientemente de la interferencia de green-Dendra2 recién sintetizado. Utilizando microscopía a base de confocal y debido a la transparencia óptica de C. elegans,es posible monitorear y cuantificar la degradación de la huntingtina-Dendra2 en un organismo vivo y envejecido. La huntingtina-Dendra2 neuronal se degrada parcialmente poco después de la conversión y se elimina aún más con el tiempo. Los sistemas que controlan la degradación son deficientes en presencia de huntingtina mutada y se ven afectados aún más por el envejecimiento. Los subtipos neuronales dentro del mismo sistema nervioso exhiben diferentes capacidades de rotación para huntingtina-Dendra2. En general, el seguimiento de cualquier proteína de interés fusionada con Dendra2 puede proporcionar información importante no sólo sobre su degradación y los actores de la red de proteostasis involucrados, sino también sobre su ubicación, tráfico y transporte.
Introduction
El proteome de un organismo vivo se está renovando constantemente. Las proteínas se degradan y sintetizan continuamente de acuerdo con la demanda fisiológica de una célula. Algunas proteínas se eliminan rápidamente, mientras que otras son de vida más larga. La monitorización de la dinámica de proteínas es una tarea más simple, precisa y menos invasiva cuando se utilizan proteínas fluorescentes codificadas genéticamente (OP). LosFP se forman autocatalíticamente y se pueden fusionar con cualquier proteína de interés (POI), pero no requieren que las enzimas se doblen o necesiten cofactores salvo oxígeno1. Recientemente se ha diseñado una nueva generación de FPs para cambiar de color tras la irradiación con un pulso de luz de longitud de onda determinada. Estos FPs fotoactivables (PAFP) permiten el etiquetado y seguimiento de PDI, o de los orgánulos o células en los que residen, y examinar sus parámetros cuantitativos y/o cualitativos2. Los FPs permiten rastrear el movimiento de cualquier PDI, la direccionalidad, la tasa de locomoción, el coeficiente de difusión, las fracciones móviles frente a las inmóviles, el tiempo que reside en un compartimiento celular, así como su tasa de rotación. Para orgánulos específicos, se pueden determinar la locomoción y el transporte, o eventos de fisión y fusión. Para un tipo de celda determinado, se puede establecer la posición, la tasa de división, el volumen y la forma de una celda. Fundamentalmente, el uso de PAFP permite el seguimiento sin visualización continua y sin interferencia de cualquier sonda recién sintetizada. Los estudios tanto en células como en organismos enteros han empleado con éxito PAFP para abordar cuestiones biológicas in vivo, como el desarrollo de cáncer y metástasis, montaje o desmontaje del citoesqueleto, e interacciones ARN-ADN/proteína3. En este manuscrito, la microscopía de luz y los PAFP se utilizan para descubrir las tasas de rotación de la proteína huntingtina propensa a la agregación (HTT) in vivo en un modelo C. elegans de enfermedad neurodegenerativa.
El protocolo descrito aquí cuantifica la estabilidad y degradación de la proteína de fusión huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 es un PAFP monomérico de segunda generación4 que cambia irreversiblemente sus espectros de emisión/excitación de verde a rojo en respuesta a la luz UV o azul visible, con un aumento en su intensidad de hasta 4.000 veces5,6. La huntingtina es la proteína responsable de causar la enfermedad de Huntington (EH), un trastorno neurodegenerativo hereditario fatal. Huntingtin exon-1 contiene un tramo de glutaminas (CAG, Q). Cuando la proteína se expresa con más de 39T, se desmoría en una proteína mutante, tóxica y patógena. El HTT mutante es propenso a la agregación y conduce a la muerte y degeneración de las células neuronales, ya sea como especies oligoméricas cortas o como amiloides altamente estructurados más grandes7.
El nematodo es un sistema modelo para el estudio del envejecimiento y la neurodegeneración gracias a su facilidad de manipulación, naturaleza isogénica, corta vida útil, y su transparencia óptica8. Para estudiar la estabilidad de HTT in vivo, se expresó una construcción de fusión en el sistema nervioso de C. elegans. Un transgén HTT-D2 que contiene un tramo fisiológico de 25Q (HTTQ25-D2) o un tramo patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) está sobreexpresado pan-neuronalmente a lo largo de la vida útil del nematodo9. Al someter a C. elegans en vivo a un punto de luz breve y centrado, una sola neurona es fotointerruptora y el HTT-D2 convertido es rastreado con el tiempo. Para establecer la cantidad de HTT-D2 degradada, la diferencia entre la señal roja del HTT-D2 recién convertido se compara con la señal roja restante de HTT-D2 después de un período de tiempo determinado. Por lo tanto, es posible investigar cómo la huntingtina se degrada cuando se encuentra en su forma expandida y tóxica en comparación con su forma fisiológica; cómo las neuronas anteriores o posteriores responden de manera diferente a la presencia de Q97 frente a Q25, especialmente durante períodos de tiempo prolongados; y cómo el colapso de la red de proteostasis (PN) durante el envejecimiento contribuye a las diferencias en las tasas de degradación. Estos resultados sólo describen un pequeño conjunto de observaciones sobre el volumen de negocios de HTT-D2. Sin embargo, muchas más preguntas biológicas relevantes tanto para el campo de la agregación de proteínas como para la proteostasis pueden abordarse con esta aplicación in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para comprender la función de una proteína es importante entender su síntesis, ubicación y degradación. Con el desarrollo de FPs novedosos, estables y brillantes, la visualización y supervisión de los PDI se ha vuelto más fácil y eficiente. Los PAFP de fusión expresada genéticamente, como Dendra2, están en una posición única para estudiar la estabilidad de un PDI. Tras la exposición a la luz púrpura-azul, Dendra2 se rompe en un lugar preciso dentro de una tríada de aminoácidos conservados. El fluorófor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la beca DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) para su financiación. También reconocemos la instalación básica de imágenes del Instituto de Investigación Leibniz de Farmacología Molecular de Berlín (FMP) por proporcionar la configuración de imágenes. Además, queremos dar las gracias a Diogo Feleciano que estableció el sistema Dendra2 en el laboratorio y proporcionó instrucciones.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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