Denne protokollen tillater differensiering av humane pluripotente celler i intestinale organoider. Protokollen etterligner normal menneskelig utvikling ved å differensiere celler til en populasjon av definitiv endoderm, baktarmendoderm og deretter tarmepitel. Dette gjør protokollen egnet for å studere både tarmutvikling og sykdomsmodelleringsapplikasjoner.
hiPSC-avledede intestinale organoider er epitelstrukturer som selvmonterer fra differensierte celler til komplekse 3D-strukturer, representative for det humane tarmepitelet, der de viser krypt / villus-lignende strukturer. Her beskriver vi genereringen av hiPSC-avledede intestinale organoider ved trinnvis differensiering av hiPSCs til definitiv endoderm, som deretter posterioriseres for å danne baktarmepitel før det overføres til 3D-kulturforhold. 3D-kulturmiljøet består av ekstracellulær matrise (ECM) (f.eks. Matrigel eller annen kompatibel ECM) supplert med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 og CHIR99021. Organoider gjennomgår passasje hver 7. dag, hvor de blir mekanisk forstyrret før overføring til fersk ekstracellulær matrise og får lov til å ekspandere. QPCR og immunocytokjemi bekrefter at hiPSC-avledede intestinale organoider inneholder modne tarmepitelcelletyper, inkludert begerceller, Paneth-celler og enterocytter. I tillegg viser organoider tegn på polarisering ved ekspresjon av villin lokalisert på den apikale overflaten av epitelceller.
De resulterende organoider kan brukes til å modellere menneskelig tarmutvikling, samt mange menneskelige tarmsykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom. For å modellere tarmbetennelse kan organoider bli utsatt for inflammatoriske mediatorer som TNF-α, TGF-β og bakteriell LPS. Organoider utsatt for proinflammatoriske cytokiner viser en inflammatorisk og fibrotisk fenotype som respons. Parring av sunne versus hiPSCs avledet fra pasienter med IBD kan være nyttig for å forstå mekanismer som driver IBD. Dette kan avsløre nye terapeutiske mål og nye biomarkører for å bistå i tidlig sykdomsdiagnose.
Egenskapene til pluripotente stamceller (PSC), som selvfornyelse og evnen til å differensiere til hvilken som helst celletype i menneskekroppen, gjør dem til verdifulle verktøy i studiet av utvikling, sykdomspatologi og narkotikatesting1. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC) er spesielt nyttige for sykdomsmodelleringsstudier, da de kan utledes fra pasienter, og direkte fange genomet som er ansvarlig for sykdommen fenotype 2,3. Slike hissc kan differensieres til celletypen som er berørt av den genetiske defekten, noe som muliggjør nøye undersøkelse av molekylær mekanisme for sykdommen4.
Differensieringsprotokoller for humane PSC-er tar sikte på å lede differensiering av celler via de viktigste utviklingsstadiene ved aktivering eller inhibering av spesifikke signalveier som styrer avstamningsforpliktelse og spesifikasjon. Vedlikehold av hiPSC i pluripotent tilstand krever moderate nivåer av Activin A (Act-A) signalering, mens en høy dose Act-A i 3 dager forplikter hiPSC til en definitiv endoderm (DE) skjebne 5,6. Act-A og Wnt veier direkte fremre-posterior identitet av DE. Signalering av Act-A induserer foregut (FG) markører som HHEX, HNF4a og GATA4, mens blokkering av ekspresjon av baktarm (HG) gener som CDX2. Wnt-signalering induserer posteriorisering av DE, som deretter vedtar en HG-genuttrykksprofil 7,8. Når HG-celleidentitet er etablert, kan differensiering flyttes fra 2D til 3D og rettes mot dannelsen av intestinale organoider.
Intestinale organoider dyrkes vanligvis i en 3D ekstracellulær matrise (f.eks. Matrigel eller andre kompatible ECM) basert kultursystem9, bestående av laminin, kollagen IV og entaktin og beriket med vekstfaktorer som EGF, FGF, PDGF og IGF-1 for å bidra til å støtte overlevelse og spredning. Organoidene dyrkes i et definert medium som inneholder Gastrin, Noggin og CHIR for å stimulere og støtte intestinal stamcellevekst og spredning under langsiktig kultur.
Etter at tarmepitelceller er innebygd i den ekstracellulære matrisen, begynner tarmkrypter å danne og utvide seg og til slutt danne sfæroider. Disse modnes til organoide strukturer som etterligner fysiologisk funksjon av tarmepitelet. Organoider kan typisk dyrkes i mer enn 1 år uten betydelig tap av funksjonelle og genuttrykksprofiler. Passaging er nødvendig på ukentlig basis ved hjelp av enzymatisk fordøyelse av organoider i mindre fragmenter som deretter selvmonteres til komplette organoider.
Etablerte organoide linjer kan brukes som en pålitelig modell av mange lidelser knyttet til tarmen, inkludert Crohns sykdom, ulcerøs kolitt og kolorektal kreft 10,11,12,13. Dette er en foretrukket modell for dyreceller, da de uttrykker menneskelige gener knyttet til disse forstyrrelsene og reagerer på ytre stimuli som ligner mer på det som forekommer i humant vev in vivo.
Her beskriver vi en protokoll for differensiering av humane pluripotente celler til humane tarmorganoider. Vi demonstrerer deres bruk for å studere betennelse; Dette kan imidlertid brukes i ulike sammenhenger, og kombinert med CRISPR / Cas9 genredigeringstilnærminger14, på hvilken som helst genetisk bakgrunn. Når de er differensiert, etter den naturlige utviklingsdifferensieringssekvensen av definitiv endoderm, baktarmendoderm og deretter tarmepitel, kan de resulterende organoider kontinuerlig dyrkes og passeres i mer enn 12 måneder.
Et kritisk aspekt ved denne protokollen er den første pletteringstettheten av udifferensierte stamceller før endodermdifferensiering. Hvis dette ikke er optimalisert tilstrekkelig, vil celler sannsynligvis dø under det første DE-differensieringstrinnet (hvis cellene er for sparsomme) eller redusere effektiviteten av DE-differensieringen (hvis cellene er for tette). Den riktige starttettheten må optimaliseres for cellelinjen som brukes, og riktig tetthet skal generere et monolag innen slutten av DE D3. Flowcytometri bør brukes for å bestemme effektiviteten av DE-spesifikasjonen, og vi ser typisk >80 % av cellene positive for SOX17 og/eller CXCR4. Når antall SOX17-positive celler er mindre enn 60%, påvirkes effektiviteten av HG-mønstre, noe som resulterer i at færre organoider dannes når de overføres til den ekstracellulære matrisen. Dette vil til slutt føre til at de resulterende organoidkulturene mislykkes. For å avgjøre om mønstre DE til HG har vært vellykket, vurderer vi antall CDX2-positive celler ved flowcytometri og forventer vanligvis å se >80% positive celler. Igjen, hvis antall CDX2-positive celler faller under 50%, vil dette ha en negativ effekt på antall intestinale organoider som genereres når de overføres til 3D ekstracellulær matrikskultur.
Etter overføring av 2D monolayers til 3D-kultur, bør små kompakte kuler vises 24-48 timer etter overføring. Store ark med døde celler kan vises avhengig av differensieringseffektiviteten for cellelinjen som brukes. I stedet for umiddelbart å passere kulturer for å fjerne disse ruskene, lar vi organoidene danne og utvikle sin mer komplekse, foldede struktur. Venter 7-10 dager før du prøver den første passeringen sikrer at tilstrekkelig delende celler er til stede for å generere mange nye intestinale organoider. Eventuelle rusk som fortsatt er tilstede i kulturen, kan lett fjernes under passeringsprosessen ved sakte å spinne de dissosierte organoid / ruskblandingene i et rør med tilstrekkelig hastighet til å pelletere organoidene, men la arket av celler flyte i media. Media og cellulært rusk kan da aspireres slik at bare pelleten av organoider forblir.
Begrensningen av denne tilnærmingen er at hiPSC-avledede celletyper ikke ofte er fullt modne når det gjelder genuttrykk og funksjonelle profiler. For å avgjøre om hiPSC-avledet tarmvev er egnet for spesifikke anvendelser, bør organoidene karakteriseres for forskjellige celletyper, inkludert enterocytter (VIL), enteroendokrine celler (neurog3), begerceller (MUC2), forbigående amplifiserende celler (CD133), panethceller (FZD5) og LGR5+ stamceller (LGR5) for å bestemme organoid cellulær sammensetning.
Samlet sett er den største fordelen med denne protokollen over mange andre organoiddifferensieringsprotokoller at denne kulturplattformen er svært kostnadseffektiv på grunn av erstatning av flere rekombinante proteiner og betingede mediepreparater med små molekyler15,16. Differensieringen til HG er veldig enkel og rask og kan brukes på både humane embryonale og induserte pluripotente stamceller med identiske utfall. Når det følges nøye, og optimalisert for cellelinjene som brukes, gir det en relativt enkel modellplattform fri for forurensende mesenkymale celler som deretter kan brukes til å studere tarmepitel i en rekke sammenhenger, inkludert betennelse, vertspatogeninteraksjoner7. Modellering av tarmfibrose kan undersøkes ved å gi profibrotiske stimuli og deretter vurdere ekspresjon av ekstracellulære matriksproteiner som kollagen, laminin og fibronektin ved QPCR, western blot og ELISA. Ved å bruke CRISPR / Cas9-genredigeringsteknikker på udifferensierte stamcellelinjer før differensiering, kan man lage genknockout eller proteinoveruttrykksorganoider som kan brukes til å lage sykdomsspesifikke organoider og mer komplekse sykdomsmodeller 14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
NH er finansiert av MRC (MR / S009930 / 1) og Wellcome Trust (204267 / Z / 16 / Z), PD er finansiert av MRC PhD DTP, KLF er finansiert av BBSRC iCASE.
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |