Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un’esposizione realistica e ripetuta all’inalazione alle particelle per le prove di tossicità.
Per le prove di tossicità delle particelle trasportate dall’aria, sono stati sviluppati sistemi di esposizione aria-liquido (ALI) per test in vitro al fine di imitare condizioni di esposizione realistiche. Ciò pone esigenze specifiche ai modelli di coltura cellulare. Molti tipi di cellule sono influenzati negativamente dall’esposizione all’aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate come una nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente) in un breve periodo di tempo. Tali condizioni sperimentali non riflettono un’esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Per superare questi limiti è stato studiato l’uso di una linea cellulare epiteliale bronchiale umana, Calu-3. Queste cellule possono essere coltivate in condizioni ALI per diverse settimane pur mantenendo una morfologia sana e un monostrato stabile con giunzioni strette. Inoltre, questo modello bronchiale è adatto per testare gli effetti di esposizioni ripetute a basse concentrazioni realistiche di particelle trasportate dall’aria utilizzando un sistema di esposizione ALI. Questo sistema utilizza un flusso d’aria continuo in contrasto con altri sistemi di esposizione ALI che utilizzano una singola nebulizzazione che produce una nuvola. Pertanto, il sistema di flusso continuo è adatto per l’esposizione ripetuta e prolungata alle particelle trasportate dall’aria, monitorando continuamente le caratteristiche delle particelle, la concentrazione di esposizione e la dose erogata. Nel complesso, questo modello bronchiale, in combinazione con il sistema di esposizione continua al flusso, è in grado di imitare condizioni realistiche e ripetute di esposizione all’inalazione che possono essere utilizzate per i test di tossicità.
I polmoni sono vulnerabili all’esposizione all’inalazione di particelle trasportate dall’aria. Per valutare la potenziale tossicità delle particelle trasportate dall’aria, sono stati compiuti progressi per sviluppare sistemi di esposizione all’interfaccia aria-liquido (ALI)1,2,3,4,5. I sistemi di esposizione ALI consentono modelli di esposizione più pertinenti e realistici rispetto all’esposizione sommersa tradizionale tramite mezzo di coltura che altera le caratteristiche e la cinetica delle particelle6. I sistemi di esposizione ALI vengono richiesti in modo specifico ai modelli di coltura cellulare, in quanto i modelli mancano di mezzi di coltura e quindi di nutrienti sul lato apicale. Molti modelli cellulari sono influenzati negativamente dall’essere coltivati ed esposti all’aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate in un breve periodo di tempo come nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente). Tali condizioni sperimentali non riflettono un’esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle; pertanto, la pertinenza dei risultati può essere messa in discussione. Per superare questi limiti, è stato ottimizzato il protocollo di coltura ed esposizione per un modello bronchiale costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale umana Calu-37.
La maggior parte dei modelli polmonari in vitro utilizzati per l’esposizione all’ALI contiene altre linee cellulari come A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) o cellule primarie come base8. Queste linee cellulari hanno lo svantaggio di rimanere vitali solo per pochi giorni quando coltivate all’ALI. Inoltre, alcune di queste linee cellulari vengono sovrascritte quando coltivate per un periodo superiore a 5 giorni. Infine, le cellule A549 mancano di giunzioni funzionali strette e quindi non possono formare una barriera stretta necessaria perimitare i polmoni 9,10. Le cellule epiteliali primarie potrebbero essere una buona opzione per l’esposizione all’ALI in quanto possono essere coltivate all’ALI per settimane. Tuttavia, le cellule primarie differiscono da lotto a lotto, sono più difficili da mantenere e sono più costose rispetto alle linee cellulari, il che le rende meno adatte per i test di tossicità e lo screening. Quando si confrontano diverse linee cellulari epiteliali bronchiali umane (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), solo le cellule Calu-3 soddisfano tutti i criteri necessari per un’esposizione ali realistica e ripetuta: rimangono vitali per settimane mentre coltivate all’ALI, forniscono un’elevata integrità barriera, non fanno crescita eccessiva e sono facili da coltura e mantenere. Le cellule calu-3 provengono da un adenocarcinoma e sono in grado di produrre muco11,12. Ci sono incongruenze sul fatto che le cellule possano sviluppare ciglia11,13. Le cellule Calu-3 sono anche un modello adatto per studiare le infezioni da virus respiratorio sinciziale (RSV) che infettano le cellule epiteliali delle vie aeree ciliate14.
Oltre al modello cellulare, viene utilizzato un sistema di esposizione automatizzato (AES) per l’esposizione aria-liquido agli aerosol15,16. L’AES ha il vantaggio di utilizzare un flusso d’aria continuo per esporre il modello cellulare agli aerosol. Questo è in contrasto con altri sistemi di esposizione aria-liquido che di solito usano concentrazioni relativamente elevate in un breve periodo di tempo come nube (cioè goccioline contenenti particelle che si depositano rapidamente)17,18,19. Questi sistemi cloud non riflettono un’esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Applicando un flusso d’aria continuo utilizzando l’AES, il modello cellulare può essere esposto a una bassa concentrazione di particelle per un periodo di tempo più lungo, riflettendo condizioni di esposizione realistiche. Un altro vantaggio rispetto ai sistemi cloud è che l’AES ha la possibilità di collegare strumenti di caratterizzazione delle particelle, consentendo la misurazione delle dimensioni delle particelle, della concentrazione dei numeri e della massa nel tempo. Una limitazione dell’AES è che utilizza flussi d’aria relativamente elevati tra 10 mL/min e 100 mL/min.
Questo articolo descrive un metodo per coltivare cellule epiteliali bronchiali umane sotto ALI ed esporre questo modello bronchiale ad aerosol o gas. Il vantaggio dell’uso delle cellule Calu-3 è che formano giunzioni strette, rimangono un monostrato, sono in grado di resistere al flusso d’aria e possono essere coltivate per settimane all’ALI, a differenza di molti altri tipi di cellule (ad esempio, 16HBE, H292 e BEAS-2B). L’utilizzo dellastazione ® esposizione automatizzata vitrocell (AES) ha il vantaggio che le cellule possono essere esposte in condizioni realistiche e rilevanti in quanto basse concentrazioni possono essere applicate utilizzando un flusso d’aria continuo.
I sistemi a flusso continuo, come l’AES, hanno vantaggi rispetto all’utilizzo di sistemi cloud3,32, che utilizzano un’unica nebulizzazione di una sospensione. Il flusso continuo è più realistico e molte variabili come portata, umidità e temperatura sono controllate. Inoltre, la deposizione può essere migliorata utilizzando un campo elettrico. Infine, le caratteristiche dell’aerosol come dimensioni, concentrazione del numero e massa vengono monitorate online. Uno svantaggio è che i sistemi di flusso continuo sono più complessi rispetto ai sistemi cloud. Pertanto, è importante eseguire esperimenti preparatori che si concentrano sulle caratteristiche delle particelle dell’aerosol e sulla dose erogata sull’inserto. La concentrazione iniziale iniziale delle particelle e le impostazioni AES possono quindi essere regolate per ottenere la dose desiderata sulle cellule33. A seconda del tipo di particelle testate, il metodo di generazione dell’aerosol può differire. L’uso della deposizione elettrostatica dipende dal tipo di particella e funziona meglio per le particelle metalliche. Per le particelle con una carica superficiale positiva deve essere applicato un campo elettrostatico negativo e viceversa.
La selezione delle concentrazioni di esposizione può essere difficile per qualsiasi esperimento di esposizione aria-liquido. Per le esposizioni al DQ12, l’obiettivo era quello di raggiungere una dose cumulativa totale di 1 μg/cm2 dopo 3 settimane di esposizione, 5 giorni alla settimana, 4 ore al giorno. Questa dose è simile alle dosi che hanno indotto un effetto in vivo21,25,27,32,33. Durante l’esecuzione delle esposizioni, c’è stata una certa variazione tra i diversi giorni di esposizione. Sebbene la dose effettiva depositata di 1,6 μg/cm2 sia superiore a quella di 1 μg/cm2 che era stata mirata, la dose potrebbe essere stata troppo bassa per osservare gli effetti nel modello Calu-3. Sono state osservate solo piccole differenze nella risposta al TEER, alla vitalità e alla citochina tra l’esposizione all’aria pulita e l’esposizione al DQ12, e queste differenze non erano statisticamente significative. Una spiegazione per l’osservazione che l’esposizione al DQ12 per 3 settimane non ha prodotto effetti significativi nelle cellule Calu-3 è che i macrofagi mancavano dal modello Calu-3. Probabilmente, dopo l’assorbimento del DQ12, i macrofagi producono citochine proinfiammatorie che possono influenzare le cellule calu-3. Un’altra spiegazione è che il batch DQ12 utilizzato per gli esperimenti non era reattivo come previsto. Quando si utilizza LPS come sostanza di controllo positiva, Calu-3 mostra una risposta, misurata da un aumento del rilascio di LDH e da un aumento del rilascio di TNF-α. Ciò indica che il modello è in grado di rilevare la tossicità.
Il modello di cella Calu-3 presenta molti vantaggi, come discusso nella sezione risultati. Inoltre, se coltivate più a lungo all’ALI, le cellule calu-3 possono coltivare strutture simili a ciglia /ciglia13 e produrre muco11,12,13. Nonostante questi vantaggi, il modello ha dei limiti rispetto alla sua rilevanza fisiologica. Le linee cellulari Calu-3 provengono da un adenocarcinoma, mentre 16HBE e BEAS-2B provengono da tessuti sani. Sfortunatamente, questi ultimi due non sono adatti per l’esposizione ripetuta all’ALI in quanto non rimangono un monostrato stabile nel tempo. Un’altra limitazione del modello Calu-3 è che rappresenta solo un singolo tipo di cella. Nel polmone umano sono presenti più tipi di cellule che interagiscono e rispondono in modo diverso all’esposizione. Le particelle inalato si depositeranno in diverse regioni dei polmoni a seconda delle loro dimensioni aerodinamiche. È qui che le particelle contattano la barriera cellulare epiteliale, come minato dal modello Calu-3. Nel polmone umano, i macrofagi alveolari sono attratti dalle particelle, le inghiottiscono e le liberano dai polmoni. I macrofagi svolgono anche un ruolo essenziale nella risposta infiammatoria all’esposizione alle particelle. Pertanto, si stanno compiendo sforzi per estendere il modello Calu-3 aggiungendo macrofagi primari per imitare più da vicino la barriera polmonare. Lo svantaggio dei macrofagi è che rimangono vitali solo per circa 7 giorni quando coltivati sopra le cellule Calu-3 dell’ALI. Pertanto, i macrofagi devono essere letti settimanalmente per trasformare l’attuale modello Calu-3 in un modello di cocultura. L’ottimizzazione del protocollo di cocultura è attualmente in corso.
Dato quanto sopra, il modello bronchiale Calu-3 è un modello adatto per l’esposizione ripetuta ad aerosol di sostanze parzialmente solubili come sostanze chimiche dal fumo di sigaretta e LPS. Queste sostanze solubili inducono aumenti significativi delle risposte delle citochine nelle cellule calu-3. Per testare particelle insolubili come lo scarico diesel e il DQ12, è necessario un modello di cocoltura, perché i macrofagi svolgono un ruolo cruciale nell’induzione degli effetti dall’esposizione alle particelle.
Per le esposizioni descritte, sono state utilizzate membrane inserte con pori da 3,0 μm. Il motivo principale per scegliere questo tipo di inserto è che è possibile testare la traslocazione dei nanomateriali. Quando si utilizza una dimensione dei pori di 0,4 μm più piccola, gli agglomerati di particelle non saranno in grado di attraversare la membrana dell’inserto. Lo svantaggio dell’uso di una grande dimensione dei pori è che le cellule hanno bisogno di un tempo più lungo per diventare confluenti e che è più difficile visualizzare la morfologia delle cellule usando la microscopia ottica. Per verificare che le celle formino un monostrato confluente, il TEER deve essere >1.000 Ω x cm2 prima di iniziare un’esposizione.
Nel complesso, il modello bronchiale Calu-3 qui presentato è adatto all’uso per l’esposizione ripetuta agli aerosol, almeno fino a 3 settimane. Il modello può resistere alla coltura e all’esposizione attraverso un flusso d’aria continuo ed è in grado di rilevare la tossicità per l’epitelio bronchiale.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è finanziato dal progetto DELL’UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) e dal Ministero olandese della Salute, del Benessere e dello Sport (progetto V/050012). Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Yvonne Staal e il Dr. Jan van Benthem per aver esaminato criticamente il manoscritto.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |