Forbedret fecundity og fertilitet Assay for Aedes aegypti ved hjælp af 24 Well Tissue Kultur Plader (EAgaL Plader)
Summary
Beskrevet er en tids- og rumbesparende metode til at tælle æg og bestemme lugehastigheder for individuelle myg ved hjælp af 24 godt vævskulturplader, hvilket kan øge omfanget og hastigheden af fecundity og frugtbarhedsanalyser betydeligt.
Abstract
Myg udgør et betydeligt folkesundhedsproblem som vektorer af forskellige patogener. For de undersøgelser, der kræver en vurdering af myg fitness parametre, især ægproduktion og luge satser på det individuelle niveau, konventionelle metoder har lagt en betydelig byrde på efterforskerne på grund af høj arbejdsintensitet og laboratorie pladskrav. Beskrevet er en simpel metode ved hjælp af 24 godt væv kultur plade med agarose i hver brønd og digital billeddannelse af hver brønd til at bestemme æg numre og luge satser på et individuelt niveau med væsentligt reduceret tid og plads krav.
Introduction
Kontrol af myg for at beskytte mennesker mod vektorbårne patogener er et vigtigt folkesundhedsmål, hovedsagelig på grund af manglen på effektive vacciner til de fleste af de patogener, der bæres af myg. Mange undersøgelser har til formål at reducere myg fitness i forbindelse med et felt-gældende befolkningsreduktion strategi1,2,3. Dette omfatter omfattende undersøgelser for at skabe transgene myg og / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Sådanne metoder til befolkningsændringer kræver en detaljeret vurdering af de enkelte fitnessparametre4. Konventionelle laboratorieteknikker til vurdering af kvindelige mygs egnethed omfatter individuel indeslutning af parrede, blodfodrede hunmyg i 100 mL beholdere5, modificerede 50 mL koniske rør eller rør til Drosophila-opdræt modificeret ved at give fugtige overflader ved hjælp af fugtige bomulds- og filterpapirskiver til fåreposition (dvs. ægpapir)1,2,6,7. Sådanne metoder kræver et relativt stort rum (f.eks. 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H i op til 100 Drosophila-rør) (figur 1) og manipulation af individuelle ægpapir til optælling af æg og rugelarver, som kan være arbejdskrævende. Dette manuskript præsenterer en metode til at tælle myggeæg og bestemme klækkehastigheder ved hjælp af 24 brøndplader og agarose som en oviposition overflade for at omgå disse spørgsmål8.
Samtidig beskrev Ioshino et al.9 en detaljeret metode ved hjælp af 12 og 24 brøndplader til at udføre ægtælling opnået fra individuelle kvinder. Deres protokol repræsenterede en betydelig forbedring i forhold til konventionelle metoder til at spare tid og plads9. Den protokol, de beskrev, fortsætter dog med at bruge vådt filterpapir som overflade til oviposition, hvilket kræver, at hvert enkelt papir foldes ud for at få tæller, da æg ofte findes under eller i folder. Deres protokol omfattede heller ikke brugen af billeddannelsesteknologier eller en metode til larvetælling.
Præsenteret er en forbedret metode til at udføre fitness assays for æg nummer (dvs. fecundity) og luge sats (dvs. frugtbarhed) ved hjælp af agarose som en oviposition overflade i en 24 godt væv kultur plade format for Ae. aegypti at oviposit på fugtige overflader. Disse plader blev navngivet “EAgaL” plader, fra Egg, Agarose, og Larva. Disse 24 brøndplader giver individuelle myg en minimal overflade til at lægge æg, hvilket forenkler og drastisk reducerer den tid og indsats, der er nødvendig for at tælle og vedligeholde æg og udklækkede larver i et par dage. EAgaL-pladen bruger gennemskinnelig agarose til ovipositionsoverfladen, hvilket eliminerer behovet for håndtering af ægpapir og finde æg og larver, når de klækkes; fotografering hver brønd etablerer en langsigtet arkiveret registrering af resultaterne og adskiller optællingsprocessen i både tid og rum fra opdræt / håndtering proces, hvor tiden ofte er begrænset.
Protocol
Representative Results
Discussion
EAgaL-pladen reducerer drastisk arbejdskraft, tid og plads til at udføre individuelle fecundity og fertilitetsanalyser i Aedes aegypti sammenlignet med FT-metoden. Den foreløbige sammenligning mellem FT-metoden og EAgaL-pladen resulterede i kortere tid for alle trin (billedteknikken blev anvendt på FT-metoden)(tabel 1). Som reference findes et skøn over start- og analyseomkostninger (en 24 brønd EAgaL-plade mod 24 FT’ er) i tabel 2.
Der …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Texas A &M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program for finansiering. Vi takker også Adelman lab medlemmer for hjælp til at udvikle denne metode og forslag, når udarbejdelsen af manuskriptet, samt Kevin Myles lab medlemmer. Vi takker også korrekturlæsere og redaktører for deres hjælp til at gøre dette manuskript bedre.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
Riferimenti
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
