والهدف من هذا البروتوكول هو رصد مستمر لديناميات عملية صيد الجزر البنكرياسية البشرية والبلدان المضيفة المساهمة مقابل الخلايا المانحة. ويتم ذلك عن طريق زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية للعين (ACE) من NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-المتلقي الماوس تليها تكرار 2-فوتون التصوير.
تصوير خلايا بيتا هو خطوة رئيسية نحو فهم زرع جزيرة. على الرغم من أن منصات التصوير المختلفة لتسجيل بيولوجيا خلايا بيتا قد تم تطويرها واستخدامها في الجسم الحي، إلا أنها محدودة من حيث السماح بدقة الخلية الواحدة والتسجيلات الطولية المستمرة. بسبب شفافية القرنية ، فإن الغرفة الأمامية للعين (ACE) في الفئران مناسبة تمامًا لدراسة بيولوجيا خلايا البنكرياس في البنكرياس البشري والفأر. هنا هو وصف لكيفية هذا النهج يمكن استخدامها لأداء التسجيلات الطولية المستمرة من التطعيم وإعادة الزرع من الطعوم الجزيرة البشرية الفردية. يتم إدخال الطعوم الجزرية البشرية في ACE، وذلك باستخدام NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-الفئران كمستلمين. وهذا يسمح للتحقيق في توسيع الخلايا المتلقية مقابل المانحة ومساهمة الخلايا المتلقية في تعزيز تغليف الأوعية الدموية من الكسب غير المشروع. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد نهج خطوة بخطوة لتحليل الصور وتحديد كمية حجم جزيرة أو الأوعية الدموية مجزأة وكبسولات جزيرة تشكيل الخلايا المتلقية.
يصف مرض السكري مجموعة من الأمراض الأيضية التي تتميز بمستويات مرتفعة من جلوكوز الدم كنتاج غير كافٍ للأنسولين من فقدان أو خلل في خلايا بيتا في البنكرياس، وغالبًا ما تكون مصحوبةً بمقاومة الأنسولين. النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D) هي الأمراض المعقدة التي الخلل التدريجي للخلايا بيتا يسبب تطور المرض. يتم تعجيل T1D من قبل هجوم المناعة الذاتية على خلايا بيتا، في حين يعتبر T2D أن تكون مدفوعة بعوامل التمثيل الغذائي، وإن كان مع أدلة متزايدة من التهاب النظامية منخفضة الدرجة1. زرع الجزر البشرية المانحة، وخاصة لمرضى T1D، ويوفر إمكانية لتوفير السيطرة الفسيولوجية نسبة السكر في الدم. ومع ذلك، فإن نقص المتبرعين بالأنسجة وضعف زراعة الجزر منعا من زراعة الجزر لتصبح خيارا علاجيا سائدة. يتم فقدان نسبة كبيرة من الكسب غير المشروع في جزيرة وظيفية في فترة ما بعد الزراعة مباشرة (24-48 ساعة) بسبب نقص الأكسجة، والتهابات، والبيئة المضيفة المناعية2،3. لتقييم كفاءة أساليب التدخل لتحسين بقاء الجزر، من الضروري الرصد المستمر لعمليات الزرع هذه.
في تقنيات الجسم الحي لتصوير وتتبع مصير الجزر البنكرياسية البشرية المزروعة بعد زرع لا يزال تحديا لأبحاث السكري4,5. حتى الآن، تقنيات التصوير غير الباضع، بما في ذلك التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) تظهر إمكانية القياس الكمي والتقييم الوظيفي الجزر المزروعة في الظروف التجريبية5. بيد أنه نظرا لصغر حجم الجزر، فإن القياسات الكمية التي تُقاس بتلك الطرائق لا تكفي. الغرفة الأمامية للعين (ACE) كموقع زرع للمراقبة هو حل التصوير غير الباضع الواعدة التي تقدم دقة مكانية أعلى بشكل فعال والرصد المتكرر على مدى فترات زمنية طويلة6. وقد تم استغلال هذه الطريقة بنجاح لدراسة علم الأحياء جزيرة الماوس (استعرضت في يانغ وآخرون7)،المناعة الذاتية الاستجاباتالمناعية 8، وكذلك الجزرة البشرية تطعيم9،10.
هنا يتم الجمع بين طريقة زرع ACE مع نهج التصوير 2-فوتون للتحقيق في ديناميات عملية engraftment جزر البنكرياس الإنسان عن طريق التسجيلات المستمرة والمكررة على الطعوم الجزيرة الفردية لمدة تصل إلى 10 أشهر بعد زرع. خصائص التصوير متعددة الصور من أعماق التصوير أكبر وخفض حجم التصوير الكلي وتلف الصورة التغلب على قيود التصوير من المجهرconfocal 11. وينطوي القياس الكمي للتصوير الفلوري على عدة مراحل، بما في ذلك إعداد عينة الجزر، وزرع الجزر، وحيازة الصور، وتصفية الصور لإزالة ضوضاء الجزر أو خلفيتها، والتجزئة، والتكديس الكمي، وتحليل البيانات. الخطوة الأكثر تحديا عادة تقسيم أو تقسيم صورة إلى أجزاء أو مناطق متعددة. ويمكن أن ينطوي ذلك على فصل الإشارة عن الضوضاء في الخلفية، أو تجميع المناطق من voxels على أساس أوجه التشابه في اللون أو الشكل للكشف عن وتسمية voxels من حجم 3D الذي يمثل الأوعية الدموية جزيرة، على سبيل المثال. بمجرد تقسيمها، إحصاءات مثل أحجام وحدة تخزين الكائن عادةً مباشرة لاستخراج. توفير طريقة لتكميم واستخراج بيانات التصوير، مثل تجزئة وتصور البيانات. ويولى اهتمام خاص لإزالة الفلورا في الجزر البشرية والتمييز بين الأوعية الدموية في جزيرة وكبسولات الجزر تشكيل الخلايا المتلقية.
يتم تقديم طريقة لدراسة عملية تطعيم خلية البنكرياس في البنكرياس البشري من خلال مراقبة مشاركة الأنسجة المتلقية والمتبرعة. بعد عملية جراحية طفيفة التوغل زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية من العين الماوس المناعي، والماوس يتعافى بسرعة في غضون دقائق بعد الجراحة. يتم تنفيذ الإجراء على عين و…
The authors have nothing to disclose.
وقد أيد هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث السويدية، منطقة البحوث الاستراتيجية Exodiab، Dnr 2009-1039، والمؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية Dnr IRC15-0067 إلى LUDC-IRC، والجمعية الملكية فيزيوغرافيا في لون، Diabetesförbundet وبارنديابيبيتسفروفوندي.
Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
-induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
-gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
Head holder | |||
-Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
-gas mask | Narishige | GM-4-S | |
-UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
-custom made metal plate for head-holder assembly | |||
-Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
Human islet culture media | |||
-CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
-HEPES | GIBCO BRL | ||
-L-glutamin | GIBCO BRL | ||
-Gentamycin | GIBCO BRL | ||
-Fungizone | GIBCO BRL | ||
-Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
-Nicotinamide | Sigma | ||
Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
2-Photon/confocal microscope | |||
-LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
-Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
-ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
-ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
-ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
-ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
-main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
-AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
-AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
-AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
-HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
-Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
-Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
Surgical tape | 3M |