생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화
Summary
이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.
Abstract
화상 진찰 베타 세포는 아일렛 이식을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 베타 세포 생물학의 기록을 위한 다른 화상 진찰 플랫폼이 개발되고 생체 내에서이용되고 있더라도, 단하나 세포 분해능 및 연속적인 세로 기록을 허용하는 측면에서 제한됩니다. 각막의 투명성 때문에 마우스내 눈의 전방 챔버(ACE)는 인간 및 마우스 췌장 세포 생물학을 연구하기에 적합합니다. 다음은 이 접근법이 개별 인간 적인 아슬렛 이식의 접목 및 개조의 연속적인 세로 기록을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 설명입니다. 인간 적인 아슬렛 이식편은 NOD를 사용하여 ACE에 삽입됩니다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4–Rag2-/-마우스를 받는 사람으로. 이것은 기증자 세포 대 수령인의 확장및 접목의 캡슐화 및 혈관화를 승진시키는 수신자 세포의 기여의 조사를 허용합니다. 또한, 배분부 또는 분할된 혈관분기 및 아슬레 캡슐 형성 수용자 세포의 이미지 분석 및 정량화를 위한 단계별 접근법이 설명된다.
Introduction
당뇨병 mellitus는 종종 인슐린 저항을 동반췌형 연하 베타 세포의 손실 또는 기능 장애에서 불충분 한 인슐린 생산의 결과로 혈당의 높은 수준을 특징으로 하는 대사 질환의 그룹을 설명합니다. 타입-1 (T1D) 및 타입-2 당뇨병 (T2D)는 베타 세포의 진보적인 기능 장애가 질병 발달을 일으키는 원인이 되는 복잡한 질병입니다. T1D는 베타 세포에 대한 자가 면역 공격에 의해 침전되고, T2D는 신진 대사 요인에 의해 구동되는 것으로 간주되는 반면, 저급 전신 염증1의증가 증거이기는하지만. 기증자 인간 섬, 특히 T1D 환자에게 이식은 생리적 혈당 조절을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나, 조직 기증자와 가난한 축 소 이식의 부족은 주류 치료 옵션이 될 수있는 islet 이식을 방지하고있다. 저산소, 염증성, 면역원성 숙주 환경2,,3으로인해 즉각적인 이식 후 기간(24-48h)에서 기능성 축약 이식의 상당 부분이 손실된다. 섬 생존의 개선을 위한 개입 방법의 효율성을 평가하기 위해, 이러한 이식의 지속적인 모니터링이 필요하다.
이식 후 이식된 인간 췌장암의 운명을 이미지화하고 추적하는 생체기술에서 여전히 당뇨병 연구에 대한 도전으로 남아있다 4,,5. 현재까지, 양성선 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI), 또는 초음파(미국)를 포함한 비침습적 이미징 기술은 실험 조건에서 이식된 섬의 정량화 및 기능적 평가가능성을보여준다 5. However, given the small islet sizes, quantitative measurements by those modalities suffer from insufficient resolution. 관찰을 위한 이식 부위로서 눈의 전방 챔버(ACE)는 장기간에 걸쳐 효과적으로 더 높은 공간 해상도와 빈번한 모니터링을 제공하는 유망한 비침습적 이미징 솔루션이다6. 이 방법은 마우스 개강 생물학(양외7에서검토), 자가면역 반응8,인간 유일 접목9,,10을연구하기 위해 성공적으로 악용되었다.
여기서 ACE 이식 방법은 이식 후 최대 10개월 동안 개별 축약 이식에 대한 연속적이고 반복된 기록에 의한 인간 췌장 이식 과정의 역학을 조사하기 위한 2-광자 이미징 접근법과 결합된다. 더 큰 이미징 깊이의 다광 화상 진찰 특성및 감소된 전반적인 광표백 및 사진 손상은 공초점 현미경검사법 11의화상 진찰 한계를 극복합니다. 형광 화상 진찰의 정량화는 islet 견본 준비, islet 이식, 화상 취득, 심상 여과를 포함하여 몇몇 단계를 관련시킵니다, 탈모 소음 또는 배경, 분할, 정량화 및 데이터 분석. 가장 어려운 단계는 일반적으로 이미지를 여러 부품 또는 영역으로 분할하거나 분할하는 것입니다. 예를 들어, 신호와 배경 잡음 또는 색상 또는 모양의 유사성에 따라 복셀의 클러스터링 영역을 분리하여 축화 를 나타내는 3D 볼륨의 복셀을 감지하고 레이블을 지정하는 것이 포함될 수 있습니다. 분할되면 개체 볼륨 크기와 같은 통계는 일반적으로 추출하기 간단합니다. 분할 및 데이터 시각화와 같은 이미징 데이터의 정량화 및 추출을 위한 방법이 제공된다. 특히 인간 섬에서 자가형광을 제거하고 아슬렛 혈관과 섬 캡슐 형성 수용자 세포를 구별하는 데 특별한 주의를 기울입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수급자와 기증자 조직의 개입을 관찰하여 인간 췌장 세포 이식 과정을 연구하는 방법이 제시된다. 면역 결핍 마우스 눈의 전방 챔버에 인간 섬을 이식 하는 최소한의 침습 수술 후, 마우스 는 수술 후 분 이내에 신속 하 게 복구. 절차는 한쪽 눈에 수행됩니다. 일반적으로, 5-7 일 이후 이식 후 각막은 충분히 인트인트 이미징을 수행 하기 위해 치유.
이 프로토콜에서는 인간 적?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 전략적 연구 지역 외디아브, Dnr 2009-1039, 전략 연구 Dnr IRC15-0067, 룬드의 왕립 물리 학회, 당뇨병퓌르분데트 및 바르니프뢰르분데트에 의해 지원되었다.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
Riferimenti
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