L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.
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Articolo metodologico
Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging delle cellule beta è un passo fondamentale verso la comprensione del trapianto di islet. Anche se diverse piattaforme di imaging per la registrazione della biologia delle cellule beta sono state sviluppate e utilizzate in vivo,sono limitate in termini di possibilità di risoluzione a singola cellula e registrazioni longitudinali continue. A causa della trasparenza della cornea, la camera anteriore dell'occhio (ACE) nei topi è adatta a studiare la biologia delle cellule dell'isolotto pancreatico umano e topo. Ecco una descrizione di come questo approccio può essere utilizzato per eseguire registrazioni longitudinali continue di innesto e revascolarizzazione di singoli innesti di isolotto umano. Gli innesti di isolotto umano vengono inseriti nell'ACE, utilizzando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-topi come destinatari. Ciò consente di sondare l'espansione delle cellule del ricevente rispetto a quelle del donatore e il contributo delle cellule riceventi nella promozione dell'incapsulamento e della vascolarizzazione dell'innesto. Inoltre, viene delineato un approccio passo-passo per l'analisi delle immagini e la quantificazione del volume dell'isolotto o della vascolatura segmentata e della capsula dell'isolotto che formano le cellule riceventi.
Introduzione
Il diabete mellito descrive un gruppo di malattie metaboliche caratterizzate da livelli elevati di glucosio nel sangue come risultato di una produzione insufficiente di insulina da perdita o disfunzione delle cellule beta delle isole pancreatiche, spesso accompagnate da insulino-resistenza. Il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D) sono malattie complesse in cui la progressiva disfunzione delle cellule beta causa lo sviluppo della malattia. T1D è precipitato da un attacco autoimmune sulle cellule beta, mentre T2D è considerato guidato da fattori metabolici, anche se con crescente evidenza di infiammazione sistemica di bassogrado 1....
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Protocollo
Il Comitato Etico Regionale di Lund, Svezia, ha approvato lo studio secondo la legge riguardante la revisione etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani. Esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in stretta conformità con l'etica svedese degli esperimenti sugli animali e approvati dai comitati etici di Malma e Lund. NOD immunodeficiente di 6-8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-pomodoro. Rag2-/-) topi ricevente sono stati utilizzati come destinatari per il trapianto di isolottiumani 10.
1. Preparazione dell'isolot....
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Risultati
Le isole umane non etichettate sono state trapiantate nell'ACE di NOD femmina di 8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA- pomodoro. Rag2- / )topi destinatari. Per prevenire il rigetto del tessuto umano, sono stati scelti come destinatari i topi da urlo Rag2 immunodeficienti. In questi topi transgenici, tutte le cellule e i tessuti hanno espresso una proteina di fluorescenza di pomodoro mirata alla membrana (mT) che consente una chi.......
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Discussione
Viene presentato un metodo per studiare il processo di innesto delle cellule dell'isolotto pancreatico umano osservando il coinvolgimento del tessuto del ricevente e del donatore. Dopo un intervento chirurgico mini-invasivo che impianta isolotti umani nella camera anteriore di un occhio di topo immunodeficiente, il topo si riprende rapidamente pochi minuti dopo l'intervento chirurgico. La procedura viene eseguita su un occhio. Generalmente, da 5-7 giorni dopo la postimplantazione in poi la cornea è sufficientemente guari.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio svedese per la ricerca, dall'Area strategica di ricerca Exodiab, dal Dnr 2009-1039, dalla Fondazione svedese per la ricerca strategica Dnr IRC15-0067 alla LUDC-IRC, alla Royal Physiographic Society di Lund, Al diabetesf-rbundet e Barndiabetesf-rbundet.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macchina per anestesia, ad es. Unità di anestesia U-400 | Agnthos | 8323001 | utilizzata per l'anestesia con isofluran durante l'intervento chirurgico e la |
| dell'imaging Agnthos | da 1,4 L | 8329002 | collegare tramite tubo all'interruttore di |
| instradamento del gas | Agnthos | 8433005 | collegare tramite tubo a U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | agente di imaging per iniezione, utilizzato per l'imaging dei vasi sanguigni negli innesti di isole umane Gruppi |
| di tubi aspiratore | Sigma | A5177-5EA | si collega con pipette capillari estratte per il prelievo manuale delle isole |
| Buprenorfina (Temgesic) 0,3 mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluido, per alleviare il dolore |
| Pipette capillari | VWR | 321242C | utilizzate insieme ai gruppi di tubi di aspirazione |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | agente di imaging per iniezione |
| Cannula oculare, estremità smussata, 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | realizzato su misura dal lineatore di idrodi conici [Blumenthal], dimensioni: 0,5 x 22 mm (25 G x 7/8 pollici) (45?), punta affusolata a 30 G ( 0,3 mm) |
| Gel per gli occhi | Novartis | Viscotears, contiene Carbomer 2 mg/g | |
| siringa Hamilton 0,5 ml, modello 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Siringa a tenuta di gas a stantuffo per iniezione di isole |
| Supporto per testi | |||
| Adattatore per il fissaggio della testa | Narishige | SG-4N-S | montato su piastra metallica-maschera |
| antigas | Narishige | GM-4-S-UST-2 | |
| Giunto universale solido | Narishige | UST-2 | assemblato su piastra metallica-piastra |
| metallica su misura per montaggio | |||
| #5, | Agnthos | 0207-5TI-PS dritto o 0208-5-PS | collegato a UST-2 (su misura) |
| Termoforo, su | fissato con nastro adesivo alla piattaforma stereotassica | ||
| Terreni di coltura di isole umane | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | terreni di coltura cellulare per isole | |
| umane-HEPES | GIBCO | ||
| GIBCO BRL-Gentamicina | |||
| GIBCO BRL-Fungizone | |||
| GIBCO BRL | |||
| -Ciproxfloxacina | Bayer healthcare AG-Nicotinamide | ||
| Sigma | |||
| Software di analisi delle immagini | Bitplane | Imaris 9 | |
| Software di acquisizione delle immagini | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Lampada a infrarossi | VWR | 1010364937 | utilizzata per mantenere gli animali al caldo nella gabbia di risveglio |
| Isoflurano Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluido, per anestesia | |
| Ago 25 G (0,5 x 16 mm), arancione | BD | 10442204 | utilizzato come bisturi |
| Piastre di Petri, 90 mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Microscopio confocale | |||
| -LSM7 MP Microscopio verticale | Zeiss-Ti | ||
| :Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai-lente | ||
| immersione in acqua a lunga distanza 20x/NA1.0 | |||
| /40m (Angiosense 680) | Chroma | ||
| /65m-2p (TR) | Chroma | ||
| /50 (GFP) | |||
| /75 (pomodoro) | Chroma-main | ||
| beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Specchio dicroico per trasmettere 690 nm e oltre e riflettere da 440 a 650 nm Dimensioni 25,5 x 36 x 1 mm |
| Tubo in polietilene (0,38 mm ID, 1,09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | per il collegamento con la siringa Hamilton e la canula |
| oculare Stereomicroscopio | Nikon | Modello SMZ645, per il prelievo di isolotti | |
| Stereomicroscopio (fluorescenza) | per l'imaging dell'innesto di | ||
| Multizoom | Nikon | a campo largo e a lunga | |
| distanza-AZ Plan Apo 1x | Nikon-AZ | ||
| Plan Apo 4x | Nikon-AZ-FL | ||
| Epifluorescenza con lampada C-LHGFI HG | Nikon-HG | ||
| Manuale Nuovo Intensilight | Nikon | ||
| - Blocco filtro Epi-FL TEXAS RED | Nikon | contiene EX540-580, DM595 e BA600-660-Epi-FL | |
| Blocco filtro G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 e BA590) | |
| -Blocco filtro Epi-FL B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 e BA520) | |
| -DS-Fi1 Fotocamera digitale a colori (5MP) | Siringa Nikon | ||
| 1 ml, Omnitix | Braun | 9161406V | per iniezione di buprenorfina, utilizzato con ago da 27 G |
| Nastro chirurgico | 3M |
Riferimenti
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014,....
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Ristampe e permessi
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