현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석
Summary
단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.
Abstract
사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 세포 과정의 핵심 단계이며 유전자 편집에 매우 중요합니다. 이 작품은 많은 단일 DNA 분자에서 SSDC를 동시에 측정할 수 있는 운동 분석을 설명합니다. 비드 테더드 기판 DNA는 각각 표적 서열의 단일 복사본을 포함하는 미세 유체 흐름 채널에서 제조된다. 외부 자석은 파라자성 구슬에 약한 힘을 적용합니다. 최대 1,000개의 개별 DN의 무결성은 넓은 분야의 낮은 배율 목표를 사용하여 암필드 이미징 에서 마이크로비드를 시각화하여 모니터링할 수 있습니다. 제한 엔도니엔탈리스의 주입, NdeI, 분열 반응을 시작합니다. 비디오 현미경 검사는 관련 비드가 목표의 초점 평면에서 위아래로 이동하는 프레임을 관찰하여 각 DNA 분열의 정확한 순간을 기록하는 데 사용됩니다. 프레임별 비드 카운팅은 반응을 정량화하고 지수핏으로 반응 속도를 결정합니다. 이 방법을 사용하면 단일 실험에서 단일 분자 SSDC 반응에 대한 정량적 및 통계적으로 유의한 데이터를 수집할 수 있습니다.
Introduction
사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 게놈 트랜잭션의 핵심 단계이다. 예를 들어, 세균 제한 수정(RM)1 및 CRISPR2 시스템은 특정 서열에서 외국 DNA를 인식하고 c떠나서 파지 및 플라스미드에 의한 공격으로부터 세포를 보호합니다. II형 RM에서, 제한 엔도니션리스(REs)는 단백질-핵산 상호작용3을통해 짧은 4-8염기쌍(bp) 서열을 인식한다. Cas9과 같은 CRISPR 관련 엔도누리스는 crRNA가 엔도니클리스4에바인딩된 대상 사이트의 혼성화를 통해 사이트에 바인딩됩니다. 사이트별 이중 좌초 휴식(DSBs)의 생성은 또한 많은 DNA 재조합 이벤트5의첫 번째 단계이다. 예를 들어, V(D)J 재조합에 의해 생성된 항원 결합 영역의 다양성은 특정 표적 부위6의인식 및 분열을 필요로 한다. 일부 트랜스포슨은 7뿐만아니라특정 DNA 서열을 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 당연히 Cas9와 같은 이러한 공정에 관여하는 많은 사이트 별 뉴클레아제는 유전자 편집 기술의 핵심 구성 요소입니다8. 또한, 새로운 사이트별 엔도나클레스(즉, 아연 핑거 뉴클레아제9 및 TALENS10)도게놈을 편집하도록 설계되었다.
많은 방법은 핵산의 사이트 별 분열의 운동학을 측정하기 위하여 채택되었습니다. 여기에는 겔 분석,형광(11,,12)및 시퀀싱 기반방법(13)이포함됩니다. DNA의 단일 분자에서 DSBs가 가닥 분리 후 비드의 움직임에 의해 검출될 수 있도록 하는 마이크로비드의 테더링으로 중요한 발전이 이루어졌습니다. 이러한 방법에서, 다른 유형의 힘은 비드 포스트 분열의 가닥 분리 및 움직임을 보장하기 위해 사용된다. 한 경우, 광학 트랩은 EcoRV14에의해 DNA의 분열을 측정하는 데 사용되었습니다. 이러한 실험에서 대상 검색은 조사의 목적이며, 사이트별 바인딩이 속도 제한 단계되도록 조건이 최적화되어 있습니다. 광학 트랩의 한 가지 단점은 한 번에 단일 DNA만 관찰할 수 있다는 것입니다. 또한, 가닥 분리를 테스트하기 위해 주기적인 큰 당기는 힘을 적용해야 한다.
또 다른 기술은 흐름과 약한 자기력의 조합을 사용하여 연속적인 방식으로 구드를당긴다(15). 이러한 방식으로, NdeI에 의한 확산 제한 분열이 측정된다. 이 방법을 사용하면 한 번에 수백 개의 DN을 동시에 측정할 수 있으므로 단일 실험에서 통계적 유의를 얻을 수 있습니다. 자기 핀셋을 기반으로 한 실험도 사용되었습니다. 이러한 연구에서는, 레트로바이러스 인테그라스는 삽입 올리고뉴클레오티드(16)에 DSB를 포함시킴으로써 연구되었다.16 성공적인 통합은 묶인 DNA에 DSB를 통합하고 부착된 비드의 손실을 초래했습니다. ATP 의존형 III 제한 엔토누리스 에코피의 유사한 연구에서, 수십 개의 DNA가 단일실험(17)에서관찰되었다. 자기 핀셋은 긴장뿐만 아니라 DNA 루핑이 반응 중에 제어및 모니터링될 수 있다는 이점을 보유하고 있습니다.
여기에 제시된 DNA의 대규모 테더링의 최근 개선을 활용하는 SSDC 운동학을 측정하기 위한 매우 병렬적인 단일 분자 방법이 있습니다. 본 방법은 DNA복제(18)및 DNA 19의 윤곽 길이, 및REs(15)에의한 절단을 측정하는 데 사용되는 이전 방법의 개선 및 확장이다.19 이 기술에서, 인식 서열의 단일 사본을 포함하는 선형 DNA는 한쪽 끝에 비오틴으로 제조되고 다른 쪽은 디곡시게닌을 제조한다. 비오틴은 파라마그네틱 마이크로비드에 공동으로 부착된 스트렙타비딘을 결합합니다. DNA 비드 복합체는 항 디곡시겐 FAB 단편으로 기능화된 미세유체 채널로 주입됩니다. 그런 다음 DNA는 디곡시게닌의 결합을 통해 표면 부착 점에 결합하여 흡착된 FAB 단편에 결합합니다. 영구 자석으로 가해지는 약한 자기력은 비포장물이 표면에 특별히 달라붙지 않도록 합니다. 시료는 골짜기 반응을 활성화하기 위해 유동 채널에 빠르게 주입(&30 s)할 수 있다. 데이터 수집 중에 흐름이 꺼져 있습니다. 각 DNA가 갈라질 때, 비드가 목표의 초점 계획에서 위아래로 이동하는 프레임을 기록하여 정확한 분열 시간을 결정할 수 있으므로 비디오 레코드에서 사라집니다. 남은 구슬의 프레임별 개구부는 반응 진행 상황을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
다음은 NdeI를 사용하여 수집된 전체 프로토콜과 예제 데이터입니다. 이 기술을 어떻게 적용할 수 있는지의 예로, 단백질 농도의 범위에 대한 절단 비율은 필수 금속 보조인인 마그네슘의 두 가지 농도로 측정됩니다. 프로토콜의 이 응용은 NdeI를 사용하지만, DNA 기판 설계를 변화시킴으로써 임의의 부위 별 뉴클레아제와 함께 사용하기 위해 방법을 조정할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 실험 중에 가닥 분리가 관찰되는 경우 모든 SSDC 시스템의 역학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 분열의 검출은 테더드 비드의 분리를 관찰하여 영향을 받아 가닥 분리의 순간을 표시한다. 모든 앞단계는 골짜기를 감지하기 전에 발생합니다. 따라서 총 전송 시간만 기록됩니다.
유동 세포 커버슬립은 항체 단백질을 깨끗한 유리에 비특이적으로 흡착하여 기능화?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 MCB-1715317에 의해 지원되었다.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
Riferimenti
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