Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi
Summary
Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Abstract
Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell’estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l’osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.
Introduction
Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l’organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L’identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza1. Mutazioni nei geni che codificano per molecole sinaptiche di adesione cellulare possono alterare negativamente le interazioni trasmissibili e possono contribuire ad alterazioni fisiopatiche nella formazione e o nel mantenimento della sinapsi.
Esistono più saggi per valutare quantitativamente le interazioni proteina-proteina come la calorimetria isotermica, il dicroismo circolare, la risonanza plasmonicasuperficiale 2 e, sebbene di natura quantitativa, hanno diversi limiti. In primo luogo, richiedono proteine ricombinanti, a volte richiedendo lunghi e noiosi passaggi di purificazione. In secondo luogo, richiedono sofisticate attrezzature specializzate e competenze tecniche. In terzo luogo, possono sopravvalutare l’estensione del legame in quanto consentono sia interazioni cis che trans tra proteine che sono naturalmente legate a una membrana in vivo. Qui proponiamo un saggio semplice e relativamente rapido che testa esclusivamente le interazioni trans.
Per aggirare molte delle complicazioni associate ai test proteici purificati, abbiamo ottimizzato un saggio di interazione proteica a base cellulare che riassume le interazioni trans in un sistema di cellule eterologhe ridotto. Questo saggio è stato precedentemente utilizzato in varie forme per studiare le interazioni transcellulari. In questo approccio, le molecole di adesione delle cellule candidate vengono trasfette in cellule HEK293T. In condizioni fisiologiche, le cellule HEK293T non mostrano auto-aggregazione, rendendole modelli esemplari per questo saggio. Tuttavia, quando vengono combinate singole popolazioni di cellule HEK che esprimono recettore e ligando, il legame del recettore e del ligando forza l’aggregazione delle cellule HEK. Questa aggregazione è mediata esclusivamente da interazioni trans ed è solitamente osservabile in decine di minuti. Non sono necessari passaggi di purificazione delle proteine in questo metodo, e l’efficienza del metodo si basa sul paradigma che le popolazioni di cellule HEK che esprimono molecole di adesione affini vengono combinate e quindi immaginiate solo decine di minuti dopo. Inoltre, questo metodo è relativamente economico, in quanto non sono necessari né anticorpi né attrezzature costose. L’unica apparecchiatura necessaria per l’acquisizione dei dati è un microscopio fluorescente standard. Un ulteriore vantaggio di questo saggio basato sulle cellule è la capacità di migliorare rapidamente l’effetto delle mutazioni puntili rilevanti della malattia sulle interazioni trans. Questo può essere eseguito trasfettando le cellule HEK con cDNA delle varianti mutanti della proteina di interesse.
In questo protocollo, presentiamo un esempio in cui studiamo se una mutazione missense in Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificata in un paziente a cui è stata diagnosticata una profonda disabilità intellettiva ed epilessia, altera le interazioni in trans con la proteina transmembrana ripetuta ricca di leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α è un membro della famiglia evolutivamente conservata di molecole di adesione cellulare presinaptica e mentre recenti lavori hanno identificato molteplici ruoli alla sinapsi3,4, 5,6,7, la nostra comprensione sinaptica di questa molecola e di tutti i membri della famiglia delle neuressine rimane incompleta. LRRTM2 è una proteina di adesione a cellule postsinaptiche eccitatorie che partecipa alla formazione e al mantenimento della sinapsi8,9,10. È importante sottolineare che LRRTM2 interagisce esclusivamente con le isoforme di neurexina che mancano dell’esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4-) ma non con isoforme di neuresina contenenti l’esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4+). La mutazione del missense umano (A687T) identificata in Neurexin3α si trova in una regione extracellulare non studiato che è conservata evolutivamente e viene conservata tra tutte le neuressine alfa7. Poiché l’interazione tra queste due molecoleè stata stabilita 8,9,11, abbiamo posto la domanda: la capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2 è alterata da una mutazione puntile A687T? Questo saggio ha rivelato che la mutazione del punto A687T ha inaspettatamente migliorato l’aggregazione di Neurexin3α a LRRTM2 suggerendo che la regione extracellulare in cui si trova la mutazione puntile, gioca un ruolo nella mediazione delle interazioni transsinattiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l’adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo deite…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Mental Health (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), una borsa di formazione pre-dottorato del National Institute of General Medicine (da T32GM007635 a S.R.) e una Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). Ringraziamo il Dr. Kevin Woolfrey per l’aiuto al microscopio, il Dr. K Ulrich Bayer per l’uso del suo microscopio epifluorescente e Thomas Südhof (Stanford University) per il plasmide LRRTM2.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
Riferimenti
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