Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux
Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.
Abstract
Les interactions protéiques aux interfaces cellulaires dictent une multitude de résultats biologiques allant du développement tissulaire et de la progression du cancer à la formation et à l’entretien de la synapse. Bon nombre de ces interactions fondamentales se produisent en trans et sont généralement induites par des interactions hétérophiliques ou homophiliques entre les cellules exprimant des paires de liaisons ancrées dans la membrane. L’élucidation de la façon dont les mutations pertinentes à la maladie perturbent ces interactions protéiques fondamentales peut donner un aperçu d’une myriade de domaines de biologie cellulaire. De nombreux analyses d’interaction protéine-protéine ne se désambigulent généralement pas entre les interactions cis et trans, ce qui conduit potentiellement à une surestimation de l’étendue de la liaison qui se produit in vivo et impliquent la purification à forte intensité de main-d’œuvre des protéines et / ou de l’équipement de surveillance spécialisée. Ici, nous présentons un protocole simple optimisé qui permet l’observation et la quantification des interactions trans seulement sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipements spécialisés. L’analyse d’agrégation cellulaire HEK implique le mélange de deux populations indépendantes de cellules HEK, chacune exprimant des ligands cognate liés à la membrane. Après une courte période d’incubation, les échantillons sont photographiés et les agrégats qui en résultent sont quantifiés.
Introduction
Les interactions synaptiques facilitées par les molécules d’adhérence synaptique sont fondamentales pour le développement, l’organisation, la spécification, la maintenance et la fonction des synapses et la génération de réseaux neuronaux. L’identification de ces molécules transsynaptiques d’adhérence de cellules augmente rapidement ; il est donc fondamentalement important d’identifier des partenaires contraignants et de comprendre comment ces nouvelles molécules d’adhérence interagissent les unes avec les autres. En outre, le séquençage du génome a identifié des mutations dans beaucoup de ces molécules d’adhérence qui sont généralement liées à une multitude de troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie1. Les mutations dans les gènes qui codent pour les molécules synaptiques d’adhérence cellulaire peuvent modifier négativement les interactions trans et peuvent contribuer à des altérations pathophysiologiques de la formation et ou de l’entretien de la synapse.
Il existe de multiples analyses pour évaluer quantitativement les interactions protéine-protéine telles que la calorimétrie isotherme, le dichroism circulaire, la résonance plasmonique de surface2 et bien que quantitatives, elles ont plusieurs limites. Tout d’abord, ils nécessitent des protéines recombinantes, exigeant parfois des étapes de purification longues et fastidieuses. Deuxièmement, ils nécessitent un équipement spécialisé sophistiqué et une expertise technique. Troisièmement, ils peuvent surestimer l’étendue de la liaison car ils permettent à la fois cis et interactions trans entre les protéines qui sont naturellement attachés à une membrane in vivo. Ici, nous proposons un test simple et relativement rapide qui teste exclusivement les interactions trans.
Pour contourner bon nombre des complications associées aux analyses de protéines purifiées, nous avons optimisé un test d’interaction protéique à base de cellules qui récapitule les interactions trans dans un système cellulaire héterologique réduit. Cet essai a été précédemment utilisé sous diverses formes pour étudier les interactions transcellulaires. Dans cette approche, les molécules d’adhérence des cellules candidats sont transfectées en cellules HEK293T. Dans des conditions physiologiques, les cellules HEK293T ne présentent pas d’auto-agrégation, ce qui en fait des modèles exemplaires pour cet essai. Cependant, lorsque des populations individuelles de cellules HEK exprimant des récepteurs et des ligands sont combinées, la liaison du récepteur et la ligand force l’agrégation des cellules HEK à se produire. Cette agrégation est médiée exclusivement par des interactions trans et est généralement observable en dizaines de minutes. Aucune étape de purification des protéines n’est requise dans cette méthode, et l’efficacité de la méthode repose sur le paradigme selon laquelle les populations de cellules HEK exprimant des molécules d’adhérence cognate sont combinées, puis photographiées seulement des dizaines de minutes plus tard. En outre, cette méthode est relativement peu coûteuse, car ni anticorps ni équipement coûteux ne sont nécessaires. Le seul équipement nécessaire à l’acquisition de données est un microscope fluorescent standard. Un avantage supplémentaire à cet essai basé sur la cellule est la capacité de dépister rapidement l’effet des mutations de point pertinentes de la maladie sur les interactions trans. Ceci peut être exécuté en transfectant des cellules de HEK avec des CDNAs des variantes mutantes de la protéine d’intérêt.
Dans ce protocole, nous présentons un exemple dans lequel nous étudions si une mutation de missense dans Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identifiée dans un patient diagnostiqué avec la déficience intellectuelle profonde et l’épilepsie, modifie des interactions dans trans avec la protéine transmembrane répétée riche en leucine 2 (LRRTM2). Neurexin3α est un membre de la famille evolutionarily conservé des molécules présynaptiques d’adhérence cellulaire et tandis que les travaux récents ont identifié de multiples rôles à la synapse3,4,5,6,7, notre compréhension synaptique de cette molécule et tous les membres de la famille neurexin reste incomplète. LRRTM2 est une protéine excitatrice d’adhérence cellulaire postsynaptique qui participe à la formation et à l’entretien de la synapse8,9,10. Fait important, LRRTM2 interagit exclusivement avec les isoformes de neurexine qui n’ont pas le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4-) mais pas avec les isoformes de neurexin contenant le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4+). La mutation de missense humaine (A687T) identifiée dans Neurexin3α est située dans une région extracellulaire non étudiée qui est evolutionarily conservée et est conservée entre tous les alpha neurexins7. Comme l’interaction entre ces deux molécules a étéétablie 8,9,11, nous avons posé la question: est la capacité contraignante de Neurexin3α SS4- à LRRTM2 modifié par une mutation point A687T? Cet essai a indiqué que la mutation de point d’A687T a augmenté de façon inattendue l’agrégation de Neurexin3α à LRRTM2 suggérant que la région extracellulaire dans laquelle la mutation ponctuelle est située, joue un rôle dans la médiation des interactions transsynaptiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disséquer les interactions protéine-protéine qui se produisent en trans pendant l’adhérence cellulaire peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus cellulaires de base, y compris la formation, la fonction et le maintien des synapses pendant la maturation et le remodelage. Les implications des interactions cellule à cellule s’élargissent au-delà de la neurobiologie et jouent un rôle plus large dans la transduction du signal, la migration cellulaire et l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du National Institute of Mental Health (R00MH103531 et R01MH116901 à J.A.), une subvention de formation prédoctorale du National Institute of General Medicine (T32GM007635 à S.R.), et une bourse Lyda Hill Gilliam pour l’étude avancée (GT11021 à S.R.). Nous remercions le Dr Kevin Woolfrey pour son aide au microscope, le Dr K Ulrich Bayer pour l’utilisation de son microscope épifluorescent et Thomas Südhof (Stanford University) pour le plasmide LRRTM2.
Materials
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
Riferimenti
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