Denne metode beskriver en protokol for høj-gennemløb proteinekstrakt forberedelse fra Caenorhabditis elegans prøver og efterfølgende co-immunoprecipitation.
Co-immunoprecipitation metoder bruges ofte til at studere protein-protein interaktioner. Bekræftelse af hypotese protein-protein interaktioner eller identifikation af nye kan give uvurderlige oplysninger om funktionen af et protein af interesse. Nogle af de traditionelle metoder til ekstraktforberedelse kræver ofte arbejdskrævende og tidskrævende teknikker. Her beskrives en modificeret ekstraktforberedelsesprotokol ved hjælp af en perlemølle homogenisator og metalperler som et hurtigt alternativ til traditionelle proteinforberedelsesmetoder. Denne ekstraktpræparatmetode er kompatibel med downstream-co-immunoprecipitationsundersøgelser. Som et eksempel blev metoden brugt til at medimforbedre C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 og to kendte ALG-1 interactors: AIN-1 og HRPK-1. Denne protokol indeholder beskrivelser af indsamling af dyreforsøg, ekstraktpræparat, ekstraktklaration og proteinim immunoprecipitation. Den beskrevne protokol kan tilpasses for at teste for interaktioner mellem to eller flere endogene, endogene mærkede eller overekspresserede C. elegans proteiner i en række genetiske baggrunde.
Identifikation af makromolekylære interaktioner af et protein af interesse kan være nøglen til at lære mere om dets funktion. Immunoprecipitation og co-immunoprecipitationseksperimenter kan bruges til at identificere hele interactomet af et protein gennem store proteomic tilgange1 eller specifikt teste et proteins evne til at coprecipitate med en hypotese interactor. I C. eleganser begge metoder med succes blevet anvendt til at lære mere om aktiviteten af en række proteiner, herunder dem, der fungerer tæt sammen med microRNA’er for at regulere genekspression2,3,4. Co-immunoprecipitation eksperimenter har den fordel, at teste protein-protein interaktioner i deres oprindelige cellulære miljø, men ekstrakt forberedelse kan være udfordrende og tidskrævende. Effektiv lysis af prøven er nødvendig, men der skal udvises forsigtighed for at minimere forstyrrelsen af proteinproteininteraktioner. Metoder som douncing5, sonikering6,Balch homogenisering7, og zirconia perler-homogenisering8,9 er blevet brugt til at forberede C. elegans samlede proteinekstrakter. Disse metoder, med undtagelse af zirconia bead homogenisering, har begrænsninger med hensyn til antallet af prøver, der kan behandles samtidigt. Præsenteret er en alternativ metode, der let kan skaleres op for at give mulighed for høj gennemstrømning, hurtigt proteinekstraktpræparat fra C. elegans prøver efterfulgt af co-immunoprecipitation. Specifikt kan metoden forberede op til 24 prøver ad gangen, hvilket i høj grad reducerer den tid, der kræves til ekstraktforberedelse. I modsætning hertil giver douncing typisk kun mulighed for en prøveforberedelse ad gangen. Denne ekstraktmetode kan bruges til at forberede ekstrakter fra ethvert udviklingsstadium i C. elegans.
Beskrevet er en trin-for-trin procedure for indsamling af dyreforsøg, ekstrakt forberedelse, immunoprecipitation, og præsentation af vestlige blotting data for at bekræfte vellykket protein pulldown og påvisning af co-immunoprecipitating protein af interesse. For at demonstrere protokollens effektivitet blev der udført to co-immunoprecipitationsforsøg mellem 1) microRNA Argonaute ALG-1 og AIN-1, en GW182 homolog; og 2) ALG-1 og HRPK-1, en nyligt identificeret ALG-1 interactor2. ALG-1 og AIN-1 er kerneproteiner, der omfatter det mikroRNA-inducerede lyddæmpningskompleks (miRISC), og samspillet mellem disse to proteiner er veletableret10,11. Ekstraktforberedelsesprotokollen var effektiv i ALG-1-AIN-1-co-immunoprecipitationseksperimentet. Denne protokol bekræftede også interaktionen mellem ALG-1 og dens nyligt identificerede interactor, HRPK-12.
Sammenfattende beskriver manuskriptet en C. elegans ekstrakt forberedelse protokol, der kan skaleres op til samtidig proces 24 prøver sammen med en co-immunoprecipitation protokol, der kan bruges til at identificere nye eller bekræfte hypotese interaktioner mellem proteiner. Ekstraktforberedelsesprotokollen er kompatibel med en række downstream-forsøg, herunder proteinim immunoprecipitation2 og microRNA-pulldowns12. Desuden kan immunoprecipitationsprotokollen tilpasses for at teste for interaktioner mellem to eller flere endogene, endogene mærkede eller overekspresserede C. elegans proteiner i en række genetiske baggrunde.
C. elegans er en fremragende model til at studere grundlæggende spørgsmål i celle-, molekylær- og udviklingsbiologi19. Ud over sin magt som et genetisk modelsystem er C. elegans modtagelig for biokemiske tilgange, herunder, men ikke begrænset til, proteinim immunoprecipitation og co-immunoprecipitation. En potentiel forhindring ved udførelse af immunoprecipitationseksperimenter er mangel på antistoffer, der er specifikke for de proteiner, der er af interesse. Hvis der ikke findes noget antistof, kan der genereres brugerdefinerede polyklonale eller monoklonale antistoffer. Imidlertid har nylige innovationer inden for genomredigeringsteknologi gjort det muligt for forskere hurtigt at introducere mutationer eller tag endogene C. elegans gener20,21, hvilket letter undersøgelser, der optrævler de genetiske, funktionelle og fysiske interaktioner mellem generne og de kodede proteiner. Specifikt har CRISPR/Cas9-medieret mærkning af C. elegans gener på den endogene loci reduceret afhængigheden af immunoprecipitationseksperimenter på antistoftilgængelighed, hvilket gør co-immunoprecipitationseksperimenter meget mere gennemførlige. C. elegans gener kan mærkes med en række tags lige fra fluorescerende tags såsom GFP eller mCherry til små tags som FLAG og HA. Antistoffer, der genkender disse tags, er let tilgængelige kommercielt, hvilket letter undersøgelserne af proteinproteininteraktioner via immunoprecipitationsmetoder.
Den præsenterede protokol, der er skitseret i figur 1, kan udføres for et lille antal prøver eller skaleres op, hvilket giver mulighed for op til 24 prøvepræparater ad gangen. Mens de indledende karakteristik af protein-protein interaktioner via immunoprecipitation er typisk sker i vilde type baggrunde under normale vækstbetingelser, opfølgende undersøgelser ofte kræver test af protein-protein interaktioner i en række genetiske baggrunde eller under forskellige vækstbetingelser. Evnen til samtidig at forberede flere ekstrakter sparer tid og, vigtigst af alt, sikrer ekstraktforberedelseskonsistens mellem de forskellige prøver. Der kræves altid en negativ kontrol, idet den ideelle kontrol er en null-mutation i genkodningen for det immunoprecipiterede protein af interesse (se figur 3 og figur 4 for eksempler).
Denne ekstraktprotokol giver mulighed for hurtig proteinekstraktpræparat fra C. elegans prøver og kan sammenlignes med zirconium perlebaseret homogenisering8. Perle homogenisering i almindelighed kan skaleres op til flere samtidige prøve præparater ved hjælp af en række perle mølle homogenisatorer eller lignende udstyr. Nogle mere økonomiske perle mølle homogenisatorer kan reducere antallet af prøver, der kan behandles samtidigt, dog. Alternativt er den fremlagte udtræksprotokol forenelig med et douncebaseret ekstraktpræparat, som udgør et økonomisk alternativ. Mens forskellige perlemølle homogenisatorer ikke blev testet, er de fleste sandsynligvis kompatible med denne proteinekstraktprotokol, så længe der opnås fuldstændig forstyrrelse af C. elegans-prøverne.
Som præsenteret er denne ekstraktforberedelsesprotokol kompatibel med flere downstream-eksperimenter, herunder proteinim immunoprecipitation2 og microRNA-pull-down12 og giver mulighed for downstream-indsamling af både protein- og RNA-komponenter. Den udvinder også effektivt både nukleare og cytoplasmiske proteiner (figur 2, figur 3og figur 4). På samme måde tillader den fremlagte immunoprecipitationsprotokol RNA-isolering fra proteinrelaterede immunoprecipitater. Mens immunoprecipitationsprotokollen oprindeligt blev udviklet til at identificere ALG-1 proteininteraktionsfaktorer, kan metoden tilpasses for at teste for interaktioner mellem proteiner af interesse. De anvendte immunoprecipitationsbetingelser fungerede faktisk lige så godt for immunoprecipiterende ALG-1 (figur 3) og HRPK-1 (figur 4). Denne protokol er et glimrende udgangspunkt for immunopurificering af RNA-bindende proteiner. Det skal dog bemærkes, at der kan være behov for visse ændringer i buffersammensætningen for andre proteiner af interesse. Ændringerne kan afhænge af de fysiske og biokemiske egenskaber ved det protein, der er af interesse, og skal gennemføres fra sag til sag.
Når målproteinet (her ALG-1 eller HRPK-1) er immunoprecipiteret, kan vestlig blotting bruges til at teste co-immunoprecipitatet for specifikke proteininteraktionsfaktorer.
Alternativt kan copurified immunoprecipitate udsættes for massespektrometri analyse for at identificere alle de formodede interagerende proteiner. Bekræftede interaktioner med co-immunoprecipitation kan derefter undersøges i en række genetiske baggrunde eller tilstande for at identificere potentiel regulering af den specifikke interaktion. For at afgøre, om hrpk-1 spiller en rolle i ALG-1/AIN-1 miRISC-samling, blev ALG-1-AIN-1-coprecipitation f.eks. vurderet både i en vild type baggrund og i mangel af HRPK-1 (Figur 3). hrpk-1 viste sig at kunne undværes til ALG-1/AIN-1 interaktion2 (Figur 3). Derudover kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi anvendes til at generere enkeltpunkts- eller domænesletningsmutationer i de proteiner, der er af interesse. At teste de genererede mutanters evne til at klare sig med deres proteininteraktionsbånd kan afsløre, hvilke domæner eller rester der formidler den fysiske interaktion. Sådanne fremtidige undersøgelser kan give uvurderlige oplysninger om mekanismen for proteinfunktion og regulering. Disse tilgange, kombineret med kraften i C. elegans genetik, kan give vigtig indsigt i de grundlæggende molekylære processer, der styrer dyrs udvikling og cellulære funktion.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Kansas INBRE, P20GM103418 til Li og Zinovyeva og R35GM124828 til Zinovyeva. Vi takker Min Han for generøst at dele anti-AIN-1 antistof. Nogle af de stammer, der anvendes i løbet af dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
N2 wild type | CGC | ||
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |