Denne metoden beskriver en protokoll for høygjennomstrømning protein ekstrakt forberedelse fra Caenorhabditis elegans prøver og påfølgende co-immunoprecipitation.
Co-immunoprecipitation metoder brukes ofte til å studere protein-protein interaksjoner. Bekreftelse av hypotesede proteinproteininteraksjoner eller identifisering av nye kan gi uvurderlig informasjon om funksjonen til et protein av interesse. Noen av de tradisjonelle metodene for ekstraktpreparat krever ofte arbeidsintensive og tidkrevende teknikker. Her beskrives en modifisert ekstraktforberedelsesprotokoll ved hjelp av en perlemølle homogenisator og metallperler som et raskt alternativ til tradisjonelle proteinforberedelsesmetoder. Denne ekstraktpreparatmetoden er kompatibel med nedstrøms co-immunoprecipitation studier. Som et eksempel ble metoden brukt til å lykkes med å co-immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 og to kjente ALG-1-interaktivitetsorer: AIN-1 og HRPK-1. Denne protokollen inkluderer beskrivelser av dyreprøvesamling, ekstraktpreparat, ekstraktavklaring og proteinimmunoprecipitation. Den beskrevne protokollen kan tilpasses for å teste for interaksjoner mellom to eller flere endogene, endogene taggete eller overekspresserte C. elegans proteiner i en rekke genetiske bakgrunner.
Å identifisere makromolekylære interaksjoner av et protein av interesse kan være nøkkelen til å lære mer om funksjonen. Immunoprecipitation og co-immunoprecipitation eksperimenter kan brukes til å identifisere hele interaktivitet av et protein gjennom store proteomiske tilnærminger1 eller for å spesifikt teste et proteins evne til å coprecipitate med en hypotesibilisert interager. I C. eleganshar begge metodene blitt brukt til å lære mer om aktiviteten til en rekke proteiner, inkludert de som fungerer tett med mikroRNAer for å regulere genuttrykk2,3,4. Co-immunoprecipitation eksperimenter har fordelen av å teste protein-protein interaksjoner i sitt opprinnelige cellulære miljø, men ekstrakt forberedelse kan være utfordrende og tidkrevende. Effektiv lysis av prøven er nødvendig, men det må tas hensyn til å minimere forstyrrelsen av proteinproteininteraksjoner. Metoder som douncing5, sonikering6, Balch homogenisering7, og zirkonia perler-homogenisering8,9 har blitt brukt til å forberede C. elegans totale proteinekstrakter. Disse metodene, med unntak av zirkonia perle homogenisering, har begrensninger når det gjelder antall prøver som kan behandles samtidig. Presentert er en alternativ metode som lett kan skaleres opp for å tillate høy gjennomstrømning, rask proteinekstraktpreparat fra C. elegansprøver etterfulgt av co-immunoprecipitation. Spesielt kan metoden forberede opptil 24 prøver om gangen, noe som reduserer tiden som kreves for ekstraktforberedelse. Til sammenligning tillater for eksempel douncing vanligvis bare ett prøvepreparering om gangen. Denne ekstraktmetoden kan brukes til å forberede ekstrakter fra et hvilket som helst utviklingsstadium av C. elegans.
Beskrevet er en trinnvis prosedyre for innsamling av dyreforsøk, ekstraktpreparering, immunoprecipitation og presentasjon av vestlige blottingsdata for å bekrefte vellykket proteinnedtrekking og påvisning av det koimmunoprecipitating protein av interesse. For å demonstrere effektiviteten av protokollen ble det utført to co-immunoprecipitation eksperimenter mellom 1) microRNA Argonaute ALG-1 og AIN-1, en GW182 homolog; og 2) ALG-1 og HRPK-1, en nylig identifisert ALG-1 interaktivitet2. ALG-1 og AIN-1 er kjerneproteiner som utgjør det microRNA-induserte silencingkomplekset (miRISC) og samspillet mellom disse to proteinene er godt etablert10,11. Ekstraktforberedelsesprotokollen var effektiv i ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitation-eksperimentet. Denne protokollen bekreftet også vellykket samspillet mellom ALG-1 og den nylig identifiserte interageren HRPK-12.
Oppsummert beskriver manuskriptet en C. elegans ekstraktforberedelsesprotokoll som kan skaleres opp til samtidig å behandle 24 prøver sammen med en koimmunoprecipitation-protokoll som kan brukes til å identifisere nye eller bekrefte hypotesede interaksjoner mellom proteiner. Ekstraktpreparatprotokollen er kompatibel med en rekke nedstrøms eksperimenter, inkludert proteinimmunoprecipitation2 og microRNA pulldowns12. Videre kan immunoprecipitation protokollen tilpasses for å teste for interaksjoner mellom to eller flere endogene, endogene tagget, eller overekspresserte C. elegans proteiner i en rekke genetiske bakgrunner.
C. elegans er en utmerket modell for å studere grunnleggende spørsmål i celle-, molekylær- og utviklingsbiologi19. I tillegg til sin kraft som et genetisk modellsystem, er C. elegans egnet til biokjemiske tilnærminger, inkludert, men ikke begrenset til, proteinimmunoprecipitation og co-immunoprecipitation. Et potensielt hinder når du utfører immunoprecipitation eksperimenter er mangel på antistoffer som er spesifikke for proteiner av interesse. Hvis ingen antistoff er tilgjengelig, kan tilpassede polyklonale eller monoklonale antistoffer genereres. Imidlertid har nyere innovasjoner innen genomredigeringsteknologi gjort det mulig for forskere å raskt introdusere mutasjoner eller merke endogene C. elegans gener20,21, og legge til rette for studier som avdekker genetiske, funksjonelle og fysiske interaksjoner mellom genene og de kodede proteinene. Spesielt crispr / cas9-mediert merking av C. elegans gener på den endogene loci har redusert avhengigheten av immunoprecipitation eksperimenter på antistoff tilgjengelighet, noe som gjør co-immunoprecipitation eksperimenter mye mer mulig. C. elegans gener kan merkes med en rekke koder som spenner fra fluorescerende koder som GFP eller mCherry til små koder som FLAG og HA. Antistoffer som gjenkjenner disse taggene er lett tilgjengelige kommersielt, noe som letter studiene av proteinproteininteraksjoner via immunoprecipitation tilnærminger.
Den presenterte protokollen, skissert i figur 1, kan utføres for et lite antall prøver eller skaleres opp, noe som gir opptil 24 prøveforberedelser om gangen. Mens de første karakteriseringene av proteinproteininteraksjoner via immunoprecipitation vanligvis gjøres i vill type bakgrunn under normale vekstforhold, krever oppfølgingsstudier ofte å teste proteinproteininteraksjonene i en rekke genetiske bakgrunner eller under forskjellige vekstforhold. Evnen til samtidig å forberede flere ekstrakter sparer tid og, viktigst, sikrer ekstraktforberedelseskonsistens blant de forskjellige prøvene. En negativ kontroll er alltid nødvendig, med den ideelle kontrollen som en nullmutasjon i genkodingen for det immunoprecipitated proteinet av interesse (se figur 3 og figur 4 for eksempler).
Denne ekstraktprotokollen muliggjør rask proteinekstraktpreparering fra C. elegans-prøver og kan sammenlignes med zirkoniumperlebasert homogenisering8. Perle homogenisering generelt kan skaleres opp til flere samtidige prøvepreparater ved hjelp av en rekke perle mill homogenisatorer eller lignende utstyr. Noen mer økonomiske perle mill homogenisatorer kan redusere antall prøver som kan behandles samtidig, men. Alternativt er den presenterte ekstraktprotokollen kompatibel med dounce-basert ekstraktpreparat, som representerer et økonomisk alternativ. Mens forskjellige perlemølle homogenisatorer ikke ble testet, vil de fleste sannsynligvis være kompatible med denne proteinekstraktprotokollen, så lenge fullstendig forstyrrelse av C. elegans-prøvene oppnås.
Som presentert er denne ekstraktforberedelsesprotokollen kompatibel med flere nedstrøms eksperimenter, inkludert proteinimmunoprecipitation2 og microRNA pull-down12 og muliggjør nedstrøms samling av både protein- og RNA-komponenter. Det trekker også effektivt ut både kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner (Figur 2, Figur 3og Figur 4). På samme måte tillater den presenterte immunoprecipitation-protokollen RNA-isolasjon fra proteinrelaterte immunoprecipitates. Mens immunoprecipitation protokollen opprinnelig ble utviklet for å identifisere ALG-1 proteininteraktorer, metoden kan tilpasses for å teste for interaksjoner mellom noen proteiner av interesse. Faktisk fungerte immunoprecipitation forholdene like bra for immunoprecipitating ALG-1 (Figur 3) og HRPK-1 (Figur 4). Denne protokollen er et utmerket utgangspunkt for immunopurifisering av RNA-bindende proteiner. Det skal imidlertid bemerkes at noen endringer i buffersammensetningen kan være nødvendig for andre proteiner av interesse. Endringene kan avhenge av de fysiske og biokjemiske egenskapene til proteinet av interesse og må implementeres fra sak til sak.
Når målproteinet (her, ALG-1 eller HRPK-1) er immunoprecipitated, kan vestlig blotting brukes til å teste co-immunoprecipitate for spesifikke proteininteraktorer.
Alternativt kan det kopurifiserte immunoprecipitaten bli utsatt for massespektrometrianalyse for å identifisere alle putative interagerende proteiner. Bekreftede koimmunoprecipitation interaksjoner kan deretter undersøkes i en rekke genetiske bakgrunner eller forhold for å identifisere potensiell regulering av den spesifikke interaksjonen. Hvis du for eksempel vil finne ut om hrpk-1 spiller en rolle i ALG-1/AIN-1 miRISC-montering, ble ALG-1-AIN-1-koduktering vurdert både i en vill type bakgrunn og i fravær av HRPK-1 (figur 3). hrpk-1 ble funnet å være dispenserbar for ALG-1/AIN-1 interaksjon2 (Figur 3). I tillegg kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi brukes til å generere enkeltpunkts- eller domeneslettingsmutasjoner i interessante proteiner. Retesting av evnen til de genererte mutantene til å korecipitate med sine proteininteraksjonorer kan avsløre hvilke domener eller rester som formidler den fysiske interaksjonen. Slike fremtidige studier kan gi uvurderlig informasjon om mekanismen for proteinfunksjon og regulering. Disse tilnærmingene, kombinert med kraften i C. elegans genetikk, kan gi viktig innsikt i de grunnleggende molekylære prosessene som styrer dyreutvikling og cellulær funksjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av Kansas INBRE, P20GM103418 til Li og Zinovyeva og R35GM124828 til Zinovyeva. Vi takker Min Han for sjenerøst å dele anti-AIN-1 antistoffet. Noen av stammene som ble brukt i løpet av dette arbeidet ble levert av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
N2 wild type | CGC | ||
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |