Denna metod beskriver ett protokoll för hög genomströmning protein extrakt beredning från Caenorhabditis elegans prover och efterföljande co-immunoprecipitation.
Metoder för samimmunprecipitation används ofta för att studera proteinproteininteraktioner. Bekräftelse av hypotetiska proteinproteininteraktioner eller identifiering av nya kan ge ovärderlig information om funktionen hos ett protein av intresse. Några av de traditionella metoderna för extraktberedning kräver ofta arbetsintensiva och tidskrävande tekniker. Här beskrivs ett modifierat extraktberedningsprotokoll med hjälp av en pärlkvarn homogenisator och metallpärlor som ett snabbt alternativ till traditionella proteinberedningsmetoder. Denna extrakt beredning metod är kompatibel med nedströms co-immunoprecipitation studier. Som ett exempel användes metoden för att framgångsrikt co-immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 och två kända ALG-1 interactorer: AIN-1 och HRPK-1. Detta protokoll innehåller beskrivningar av insamling av djurprov, extraktberedning, förtydligande av extrakt och proteinimmunprecipitation. Det beskrivna protokollet kan anpassas för att testa interaktioner mellan två eller flera endogena, endogent märkta eller överuttryckta C. elegans proteiner i en mängd olika genetiska bakgrunder.
Att identifiera makromolekylära interaktioner av ett protein av intresse kan vara nyckeln till att lära sig mer om dess funktion. Immunoprecipitation och co-immunoprecipitation experiment kan användas för att identifiera hela interactome av ett protein genom storskaliga proteomic metoder1 eller att specifikt testa ett proteins förmåga att coprecipitate med en hypotetisk interactor. I C. eleganshar båda metoderna framgångsrikt använts för att lära sig mer om aktiviteten hos en mängd olika proteiner, inklusive de som nära fungerar med mikroRNA för att reglera genuttryck2,3,4. Co-immunoprecipitation experiment har fördelen att testa protein-protein interaktioner i sin inhemska cellulära miljö, men extrakt förberedelse kan vara utmanande och tidskrävande. Effektiv lys av provet är nödvändigt, men försiktighet måste vidtas för att minimera störningarna i proteinproteininteraktioner. Metoder som douncing5, ultraljudsbehandling6, Balch homogenisering7, och zirconia pärlor-homogenisering8,9 har använts för att framgångsrikt förbereda C. elegans totala protein extrakt. Dessa metoder, med undantag för zirconia pärla homogenisering, har begränsningar när det gäller antalet prover som kan bearbetas samtidigt. Presenteras är en alternativ metod som lätt kan skalas upp för att möjliggöra hög genomströmning, snabb proteinextraktberedning från C. elegans prover följt av co-immunoprecipitation. Specifikt kan metoden förbereda upp till 24 prover åt gången, vilket kraftigt minskar den tid som krävs för extraktberedning. Däremot tillåter till exempel douncing vanligtvis endast ett provberedning i taget. Denna extraktmetod kan användas för att förbereda extrakt från alla utvecklingsstadier av C. elegans.
Beskrivs är ett steg-för-steg förfarande för djur prov insamling, extrakt beredning, immunoprecipitation och presentation av västerländska blotting data för att bekräfta framgångsrika protein pulldown och detektion av co-immunoprecipitating protein av intresse. För att visa protokollets effektivitet utfördes två co-immunoprecipitation experiment mellan 1) microRNA Argonaute ALG-1 och AIN-1, en GW182 homolog; och 2) ALG-1 och HRPK-1, en nyligen identifierad ALG-1 interactor2. ALG-1 och AIN-1 är kärnproteiner som utgör det mikroRNA-inducerade tysthetskomplexet (miRISC) och interaktionen mellan dessa två proteiner är väl etablerad10,11. Extrakt förberedelse protokollet var effektivt i ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitation experiment. Detta protokoll bekräftade också framgångsrikt interaktionen mellan ALG-1 och dess nyligen identifierade interactor, HRPK-12.
Sammanfattningsvis beskriver manuskriptet ett C. elegans extrakt förberedelseprotokoll som kan skalas upp för att samtidigt bearbeta 24 prover tillsammans med ett co-immunoprecipitation protokoll som kan användas för att identifiera nya eller bekräfta hypotetiska interaktioner mellan proteiner. Extraktberedningsprotokollet är kompatibelt med ett antal nedströmsexperiment, inklusive proteinimmunprecipitation2 och microRNA pulldowns12. Dessutom kan immunoprecipitation protokollet anpassas för att testa för interaktioner mellan två eller flera endogena, endogent märkta eller överuttryckta C. elegans proteiner i en mängd olika genetiska bakgrunder.
C. elegans är en utmärkt modell för att studera grundläggande frågor inom cell-, molekylär- och utvecklingsbiologi19. Förutom sin kraft som ett genetiskt modellsystem är C. elegans mottaglig för biokemiska metoder, inklusive, men inte begränsat till, proteinimmunprecipitation och co-immunoprecipitation. Ett potentiellt hinder vid immunprecipitationsexperiment är brist på antikroppar som är specifika för de proteiner som är av intresse. Om ingen antikropp finns tillgänglig kan anpassade polyklonala eller monoklonala antikroppar genereras. Men de senaste innovationerna inom genomredigeringsteknik har gjort det möjligt för forskare att snabbt införa mutationer eller märka endogena C. elegans gener20,21, vilket underlättar studier som löser upp de genetiska, funktionella och fysiska interaktionerna mellan generna och de kodade proteinerna. Specifikt har CRISPR/Cas9-medierad märkning av C. elegans gener vid den endogena lokusen minskat beroendet av immunoprecipitation experiment på antikropp tillgänglighet, vilket gör co-immunoprecipitation experiment mycket mer genomförbara. C. elegans gener kan märkas med en mängd olika taggar som sträcker sig från fluorescerande taggar som GFP eller mCherry till små taggar som FLAG och HA. Antikroppar som känner igen dessa taggar är lätt tillgängliga kommersiellt, vilket underlättar studier av proteinproteininteraktioner via immunprecipitationsmetoder.
Det framlade protokollet, som beskrivs i figur 1,kan utföras för ett litet antal prover eller skalas upp, vilket möjliggör upp till 24 provpreparat åt gången. Medan de första karakteriseringarna av proteinproteininteraktioner via immunprecipitation vanligtvis görs i vilda bakgrunder under normala odlingsförhållanden, kräver uppföljningsstudier ofta testning av proteinproteininteraktioner i en mängd olika genetiska bakgrunder eller under olika tillväxtförhållanden. Förmågan att samtidigt förbereda flera extrakt sparar tid och, viktigast av allt, säkerställer extraktberedningskonsistens mellan de olika proverna. En negativ kontroll krävs alltid, med den idealiska kontrollen är en nollmutation i genkodningen för det immunoprecipiterade proteinet av intresse (se figur 3 och figur 4 för exempel).
Detta extraktprotokoll möjliggör snabb proteinextraktberedning från C. elegans prover och är jämförbart med zirkonium pärla-baserade homogenisering8. Pärlhom homogenisering i allmänhet kan skalas upp till flera samtidiga provpreparat med hjälp av en mängd olika pärlkvarn homogenisatorer eller liknande utrustning. Vissa mer ekonomiska pärlkvarn homogenisatorer kan dock minska antalet prover som kan bearbetas samtidigt. Alternativt är det presenterade extraktprotokollet kompatibelt med dounce-baserade extrakt förberedelse, som representerar ett ekonomiskt alternativ. Även om olika pärlkvarn homogenisatorer inte testades, de flesta är sannolikt kompatibla med detta protein extrakt protokoll, så länge fullständig störning av C. elegans prover uppnås.
Som presenteras, detta extrakt förberedelse protokoll är kompatibel med flera nedströms experiment, inklusive protein immunprecipitation2 och microRNA pull-down12 och möjliggör nedströms insamling av både protein och RNA komponenter. Det extraherar också effektivt både nukleära och cytoplasmaproteiner(figur 2, figur 3och figur 4). På samma sätt tillåter det presenterade immunoprecipitation protokollet RNA isolering från protein-associerade immunoprecipitates. Medan immunoprecipitation protokollet ursprungligen utvecklades för att identifiera ALG-1 protein interactors, metoden kan anpassas för att testa för interaktioner mellan alla proteiner av intresse. De immunprecipitationsförhållanden som användes fungerade faktiskt lika bra för immunoprecipiterande ALG-1 (figur 3) och HRPK-1 (figur 4). Detta protokoll är en utmärkt utgångspunkt för immunpurifiering av RNA-bindande proteiner. Det bör dock noteras att vissa förändringar i buffertsammansättningen kan krävas för andra proteiner av intresse. Förändringarna kan bero på de fysiska och biokemiska egenskaperna hos det protein som är av intresse och måste genomföras från fall till fall.
När målproteinet (här, ALG-1 eller HRPK-1) är immunoprecipitated, kan western blotting användas för att testa co-immunoprecipitate för specifika protein interactors.
Alternativt kan det samförda immunprecipitatet utsättas för masspektrometrianalys för att identifiera alla förmodade interagerande proteiner. Bekräftade samimmunprecipitation interaktioner kan sedan undersökas i en mängd olika genetiska bakgrunder eller villkor för att identifiera potentiella reglering av den specifika interaktionen. För att till exempel avgöra om hrpk-1 spelar en roll i ALG-1/AIN-1 miRISC-sammansättning bedömdes ALG-1-AIN-1-koprecipitation både i en vild typbakgrund och i avsaknad av HRPK-1 (figur 3). hrpk-1 konstaterades vara dispenserbart för ALG-1/AIN-1 interaktion2 (Figur 3). Dessutom kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik användas för att generera enstaka punkt- eller domänborttagningsmutationer i de proteiner som är av intresse. Att testa de genererade mutanternas förmåga att koprecipitera med sina proteininteraktorer kan avslöja vilka domäner eller rester som förmedlar den fysiska interaktionen. Sådana framtida studier kan ge ovärderlig information om mekanismen för proteinfunktion och reglering. Dessa tillvägagångssätt, i kombination med kraften i C. elegans genetik, kan ge viktiga insikter i de grundläggande molekylära processer som styr djurs utveckling och cellulära funktion.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av Kansas INBRE, P20GM103418 till Li och Zinovyeva och R35GM124828 till Zinovyeva. Vi tackar Min Han för att han generöst delade anti-AIN-1-antikroppen. Några av de stammar som användes under detta arbete tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
N2 wild type | CGC | ||
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |