Modello di onda d'esplosione a bassa intensità per la valutazione preclinica della lesione cerebrale traumatica lieve a testa chiusa nei roditori

Summary

Presentiamo qui un protocollo di un modello di onda d’urto per i roditori per studiare gli effetti neurobiologici e fisiopatologici di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate. Abbiamo stabilito una configurazione da banco a gas dotata di sensori di pressione che consentono una generazione affidabile e riproducibile di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate indotte da esplosioni.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica su larga scala. Il TBI lieve è la forma più diffusa di neurotrauma e rappresenta un gran numero di visite mediche negli Stati Uniti. Attualmente non ci sono trattamenti approvati dalla FDA disponibili per TBI. L’aumento dell’incidenza di TBI militari e indotti da blasti accentua ulteriormente l’urgente necessità di trattamenti TBI efficaci. Pertanto, nuovi modelli animali preclinici di TBI che ricapitolano aspetti del TBI correlato all’esplosione umana faranno progredire notevolmente gli sforzi di ricerca sui processi neurobiologici e fisiopatologici alla base del TBI da lieve a moderato, nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per TBI.

Qui presentiamo un modello affidabile e riproducibile per lo studio degli effetti molecolari, cellulari e comportamentali del TBI indotto da blast da lieve a moderato. Descriviamo un protocollo passo-passo per tbiti lievi a testa chiusa e indotti da esplosioni nei roditori utilizzando una configurazione da banco costituita da un tubo d’urto azionato da gas dotato di sensori di pressione piezoelettrici per garantire condizioni di prova coerenti. I vantaggi della configurazione che abbiamo stabilito sono il suo relativo basso costo, facilità di installazione, facilità d’uso e capacità di throughput elevato. Ulteriori vantaggi di questo modello TBI non invasivo includono la scalabilità della sovrapressione del picco di esplosione e la generazione di risultati riproducibili controllati. La riproducibilità e la rilevanza di questo modello TBI è stata valutata in una serie di applicazioni a valle, tra cui analisi neurobiologiche, neuropatologiche, neurofisiologiche e comportamentali, a supporto dell’uso di questo modello per la caratterizzazione dei processi alla base dell’eziologia del TBI da lieve a moderato.

Introduction

La lesione cerebrale traumatica (TBI) rappresenta oltre due milioni di visite ospedaliere ogni anno solo negli Stati Uniti. I TBI lievi comunemente derivanti da incidenti automobilistici, eventi sportivi o cadute rappresentano circa l’80% di tutti i casi di ^TBI1. Il TBI lieve è considerato la “malattia silenziosa” in quanto i pazienti spesso non manifestano sintomi evidenti nei giorni e nei mesi successivi all’insulto iniziale, ma possono sviluppare gravi complicanze correlate al TBI più tardi nella ^vita2. Inoltre, il TBI lieve indotto da blast è prevalente tra i membri del servizio militare ed è stato associato a disfunzione cronica del SNC3,4,5,6. A causa della crescente incidenza di ^TBI7,8 lieve correlato all’esplosione, la modellazione preclinica dei processi neurobiologici e fisiopatologici associati al TBI lieve è quindi diventata un punto focale nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici per TBI.

Storicamente, la ricerca sul TBI si è concentrata principalmente sulle forme gravi di neurotrauma, nonostante il numero relativamente inferiore di casi gravi di TBI umano. Sono stati sviluppati modelli preclinici di roditori per TBI umani gravi, compresi i modelli di impatto corticale controllato (CCI)^9,10 e lesioni da percussione fluida (FPI)¹¹, entrambi ben consolidati per produrre effetti fisiopatologici ^{affidabili12,13}. Questi modelli hanno gettato le basi per ciò che è noto oggi sulla neuroinfiammazione, la neurodegenerazione e la riparazione neuronale nel TBI. Sebbene sia stata sviluppata una notevole conoscenza della fisiopatologia del TBI, attualmente non sono disponibili trattamenti efficaci approvati dalla FDA per tbi.

Più recentemente, il focus della ricerca TBI è stato ampliato per includere uno spettro più ampio di patologie correlate al TBI con l’obiettivo finale di sviluppare interventi terapeutici efficaci. Tuttavia, sono stati stabiliti pochi modelli preclinici per TBI lieve che hanno mostrato effetti misurabili e solo un piccolo numero di studi ha studiato lo spettro TBI lieve2,14,15. Poiché il TBI lieve rappresenta la grande maggioranza di tutti i casi di TBI, sono urgentemente necessari modelli affidabili di TBI lieve per facilitare la ricerca sull’eziologia e la neuropatofisiologia della condizione umana, al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche.

In collaborazione con ingegneri biomedici e fisici aerospaziali, abbiamo stabilito un modello scalabile di onde d’urto a testa chiusa per TBI da lieve a moderato. Questo modello di roditore preclinico è stato specificamente sviluppato per studiare gli effetti della dinamica della forza, comprese le onde d’urto e il movimento di accelerazione / decelerazione, che sono associati al LIEVE TBI umano ottenuto in combattimenti militari, eventi sportivi, incidenti automobilistici e cadute. Poiché le onde d’urto sono correlate con le dinamiche di forza che causano tbi lieve negli esseri umani, questo modello è stato progettato per produrre una forma d’onda di Friedlander coerente con un impulso, che viene misurato come libbre per pollice quadrato (psi) * millisecondo (ms). Il livello di impulso viene scalato per scendere al di sotto delle curve di letalità polmonare definite per topi e ratti al fine di condurre indagini precliniche16,17,18. Inoltre, questo modello consente di indagare sulle lesioni da colpo di stato e contrecoup dovute alle rapide forze di rotazione della testa dell’animale. Questo tipo di lesione è inerente a diversi tipi di presentazioni cliniche di TBI, comprese quelle osservate sia nella popolazione militare che in quella civile. Pertanto, questo modello versatile si adatta a un’esigenza che comprende più presentazioni cliniche di TBI.

Il modello preclinico qui presentato produce cambiamenti fisiopatologici affidabili e riproducibili associati a TBI clinica lieve, come dimostrato da una serie di studi precedenti17,19,20,21,22,23. Gli studi con questo modello hanno dimostrato che i ratti sottoposti a un’onda d’urto a bassa intensità hanno mostrato neuroinfiammazione, danno assonale, danno microvascolare, cambiamenti biochimici legati a lesioni neuronali e deficit di plasticità a breve termine ed eccitabilità ^sinaptica19. Tuttavia, questo modello lieve di TBI non ha indotto alcun cambiamento neuropatologico macroscopico, inclusi danni tissutali, emorragie, ematomi e contusioni19 che sono stati comunemente osservati in studi che hanno utilizzato modelli di TBI invasivi da moderati a ^gravi10,24. Ricerche precedenti19,21,22,23 hanno dimostrato che questo modello preclinico può essere utilizzato per caratterizzare i processi neurobiologici e fisiopatologici alla base dell’eziologia del TBI lieve e moderato17,19,20,21,22,23. Questo modello consente anche di testare nuovi composti e strategie terapeutiche, nonché l’identificazione di nuovi bersagli adatti per lo sviluppo di interventi TBI efficaci19,21,22,23.

Questo modello è stato sviluppato per studiare gli effetti indotti dalle onde d’urto e le forze rotazionali rapide sugli esiti molecolari, cellulari e comportamentali nei roditori. Analogamente al modello di onda d’urto qui presentato, è stato sviluppato un certo numero di modelli preclinici che tentano di ricapitolare TBI da lieve a moderato utilizzando onde di sovrapressione guidate dal gas2,14,17,25,26,27,28. Alcune delle limitazioni di altri modelli includono: l’animale è fissato a una gabbia di rete metallica e la testa è immobilizzata all’impatto; gli organi periferici sono esposti all’onda oltre al cervello, che crea le variabili confondenti del politrauma; e i modelli sono grandi e stazionari, il che limita la modifica e l’adattamento dei parametri critici a migliori condizioni del modello che ricordano il TBI umano.

I vantaggi di questa configurazione del tubo d’urto da banco a gas sono il suo costo relativamente basso per le spese di acquisizione e gestione, nonché la facilità di installazione e utilizzo. Inoltre, la configurazione consente un funzionamento ad alto rendimento e la generazione di onde d’urto riproducibili controllate e risultati in vivo sia nei topi che nei ratti. Al fine di controllare condizioni di prova coerenti (ad esempio, onda d’urto costante e sovrapressione) la configurazione è dotata di sensori di pressione. I vantaggi di questo modello per TBI includono la scalabilità della gravità della lesione e che il TBI lieve viene indotto utilizzando una procedura non invasiva a testa chiusa. La sovrapressione di picco e la successiva lesione cerebrale aumentano con membrane di poliestere più spesse in modo scalabile e ^coerente17. La capacità di scalare la gravità del TBI attraverso lo spessore della membrana è uno strumento utile per determinare il livello, al quale diventano evidenti specifiche misure di esito (ad esempio, neuroinfiammazione). Fornendo una schermatura protettiva per gli organi periferici, consente anche un’indagine mirata sui meccanismi del TBI lieve evitando o riducendo le variabili confondenti della lesione sistemica, come le lesioni polmonari o toraciche. Inoltre, questa configurazione consente di selezionare la direzione, con cui l’onda d’urto colpisce / penetra nella testa (cioè frontalmente, lateralmente, superiore o inferiore) e quindi possono essere indagati diversi tipi di insulti che inducono TBI. La procedura standard per indurre TBI da lieve a moderata qui descritta impiega l’esposizione laterale per valutare gli effetti della lesione da onda d’urto in combinazione con lesioni da colpo di stato e contrecoup a causa di forze di rotazione rapide. Inoltre, al fine di studiare esclusivamente le lesioni indotte da esplosioni, in questo modello può essere impiegata l’esposizione alle onde d’urto dall’alto verso il basso.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell’Università di Cincinnati e della West Virginia University. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l’Uso degli Animali (IACUC) e sono state eseguite secondo i principi della Guida per la Cura e l’Uso degli Animali da Laboratorio. 1. Installazione della configurazione BLAST TBI Acquisire tutte le parti di lavoro necessarie per la con…

Representative Results

La scalabilità della configurazione delle onde d’urto è stata testata utilizzando tre diversi spessori di membrana, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. I livelli di pressione di picco sono stati valutati nell’area di posizionamento della testa e l’uscita dell’apparato del tubo d’urto utilizzando sensori di pressione piezoelettrici (vedere Figura 1 e Figura 2). Le pressioni di picco aumentano in concordanza con lo spessore della membrana in entrambe le posizioni del sensore…

Discussion

Presentiamo qui un modello preclinico di TBI lieve che è conveniente, facile da configurare ed eseguire e consente risultati sperimentali ad alta produttività, affidabili e riproducibili. Questo modello fornisce una schermatura protettiva agli organi periferici per consentire un’indagine mirata sui meccanismi tbisidi lievi, limitando al contempo le variabili confondenti del danno sistemico. Al contrario, altri modelli di esplosione sono noti per infliggere danni agli organi periferici2,39,40.<su…

Materials

3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator – Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing – 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40×3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench – 3/16''	S&K	73310