Cultuur van brain capillaire pericyten voor cytosolische calciummetingen en calciumbeeldvormingsstudies
Summary
Hersencapillaire pericyten zijn essentiële spelers in de regulatie van bloed-hersenbarrière eigenschappen en bloedstroom. Dit protocol beschrijft hoe hersencapillaire pericyten kunnen worden geïsoleerd, gekweekt, gekenmerkt met betrekking tot celtype en toegepast voor onderzoeken van intracellulaire calcium signalering met fluorescerende sondes.
Abstract
Pericyten worden geassocieerd met endotheelcellen en astrocytische endfeet in een structuur die bekend staat als de neurovasculaire eenheid (NVU). Brain capillary pericyte functie is niet volledig bekend. Pericyten zijn voorgesteld om betrokken te zijn bij capillaire ontwikkeling, regulering van endotheelbarrièredichtheid en trancytoseactiviteit, regulering van capillaire toon en om cruciale rollen te spelen in bepaalde hersenpathologieën.
Pericyten zijn een uitdaging om te onderzoeken in de intacte hersenen als gevolg van de moeilijkheden bij het visualiseren van processen in de hersenen parenchyma, evenals de nabijheid van de andere cellen van de NVU. Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie en cultuur van primaire boviene hersenen capillaire pericyten en hun volgende gebruik in calcium imaging studies, waar effecten van agonisten die betrokken zijn bij de hersenen signalering en pathologieën kunnen worden onderzocht. Corticale capillaire fragmenten mogen zich aan de bodem van kweekkolven hechten en na 6 dagen zijn endotheelcellen en pericyten uit de haarvaten gegroeid. De endotheelcellen worden verwijderd door zachte trypsinisatie en pericyten worden gekweekt voor 5 extra dagen alvorens te overgaan.
Geïsoleerde pericyten worden gezaaid in 96-well kweekplaten en geladen met de calciumindicatorkleurstof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) om metingen van intracellulaire calciumniveaus in een opstelling van de plaatlezer mogelijk te maken. Als alternatief worden pericyten op coverslips gezaaid en in celkamers gemonteerd. Na het laden met de calciumindicator (Cal-520 AM) kan calcium live-imaging worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie op een excitatiegolflengte van 488 nm en emissiegolflengte van 510-520 nm.
De hier beschreven methode is gebruikt om de eerste intracellulaire calciummetingen te verkrijgen van primaire hersencapillaaire pericyten, waaruit blijkt dat pericyten worden gestimuleerd via ATP en in vitro kunnen samentrekken.
Introduction
Hersencapillary pericyten vormen samen met endotheelcellen en astrocyten de NVU1,2,3. De endotheelcellen, die de structurele basis van de haarvaten vormen, vormen lange cilindrische buizen met een diameter van 5-8 μm. De endotheelcellen zijn sporadisch bedekt met pericyten en omgeven door uitsteeksels van astrocyten; de astrocyten eindvoeten.
De bloed-hersenbarrière (BBB), gelegen in de hersenvaten, is de belangrijkste plaats voor de uitwisseling van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen tussen de hersenen en het bloed. De BBB beschermt ook de hersenen tegen endogene en exogene neurotoxinen en dient als een barrière voor de levering van een groot aantal geneesmiddelenverbindingen. De barrièrefunctie is een aandachtsgebied, evenals een obstakel, voor farmaceutische bedrijven die geneesmiddelen ontwikkelen voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Dit heeft een grote belangstelling aangespoord voor het onderzoek naar de cellen van de NVU in cultuur4. Hersen astrocyten en endotheelcellen zijn gekweekt en gekenmerkt in een aantal studies, terwijl de studies en protocollen voor pericyte cultuur zijn schaars.
Eerder gepubliceerde protocollen hebben de generatie van hersencapillaire pericyte culturen tot op zekere hoogte beschreven, met behulp van een reeks verschillende benaderingen, zoals immunopanning5,hoog- en laagglucose media6, fluorescerend geactiveerde celsorden7, dichtheidgradiëntcentrifugatie8, enz. Hoewel deze methoden voldoende lijken om culturen van pericyten te verkrijgen, zijn sommige tijdrovend, duur en de verkregen pericyten misschien niet ideaal vanwege het aantal cultuurpassages dat de pericyten9kan de-differentiëren. Bovendien is het potentieel van gekweekte pericyten in in vitro signaleringsstudies tot nu toe vrij onontgonnen.
Het huidige werk richt zich op het genereren van pericyte culturen uit geïsoleerde runderhersenvaten haarvaten en de daaropvolgende opstelling voor metingen en beeldvorming studies van veranderingen in intracellulair calcium, een belangrijke intracellulaire tweede boodschapper. We beschrijven kort de isolatie van haarvaten van corticale grijze stof (voor details zie Helms et al.10)en de isolatie en cultuur van pericyten in pure monocultuur zonder besmetting met endotheel of gliacellen. Vervolgens bieden we een protocol voor het zaaien van pericyten in 96-well platen en laadprotocollen voor de calciumsonde Fura-2 AM. Tot slot laten we zien hoe pericyten kunnen worden gebruikt in real-time confocale beeldvorming in microscoopcultuurkamers en beschrijven we de protocollen hiervoor.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een methode gepresenteerd om primaire pericyten te isoleren van runderhersenen. Het beschreven protocol staat cultuur van dit anders eerder ontoegankelijke celtype toe. De later verkregen celkweek was een bijna homogene populatie van pericyten, met weinig of geen besmetting met endotheelcellen en gliacellen op basis van celmorfologie en eiwitexpressie12. Bovendien hebben we een eenvoudige en eenvoudige methode aangetoond om de pericyten te laden met calciumkleurstoffen voo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de financiering van de Lundbeck Foundation Research initiatief on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) en Simon Hougners Family Foundation te erkennen.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
Riferimenti
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
