Coltura di periciti capillari cerebrali per misurazioni citosoliche del calcio e studi di imaging del calcio

Summary

I periciti capillari cerebrali sono attori essenziali nella regolazione delle proprietà della barriera ematica-encefalica e del flusso sanguigno. Questo protocollo descrive come i periciti capillari cerebrali possono essere isolati, coltivati, caratterizzati rispetto al tipo di cellula e applicati per le indagini sulla segnalazione intracellulare del calcio con sonde fluorescenti.

Abstract

I periciti sono associati alle cellule endoteliali e ai piedi finali astrocitici in una struttura nota come unità neurovascolare (NVU). La funzione del pericita capillare cerebrale non è completamente nota. I periciti sono stati suggeriti per essere coinvolti nello sviluppo capillare, nella regolazione della tenuta barriera endoteliale e nell’attività della trancytosis, nella regolazione del tono capillare e nel svolgere ruoli cruciali in alcune patologie cerebrali.

I periciti sono difficili da indagare nel cervello intatto a causa delle difficoltà nel visualizzare i processi nel parenchima cerebrale, così come la vicinanza alle altre cellule dell’NVU. Il presente protocollo descrive un metodo per l’isolamento e la coltura dei periciti capillari del cervello bovino primario e il loro successivo utilizzo negli studi di imaging del calcio, in cui possono essere studiati gli effetti degli agonisti coinvolti nella segnalazione cerebrale e nelle patologie. I frammenti capillari corticali sono autorizzati ad attaccarsi al fondo dei contenitori di coltura e, dopo 6 giorni, cellule endoteliali e periciti sono cresciuti dai frammenti capillari. Le cellule endoteliali vengono rimosse mediante tripsinazione delicata e i periciti vengono coltivati per altri 5 giorni prima della passaging.

I periciti isolati vengono seminati in piastre di coltura da 96 porcili e caricati con il colorante indicatore del calcio (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) per consentire misurazioni dei livelli di calcio intracellulare in una configurazione del lettore di lastre. In alternativa, i periciti vengono seminati su coverlips e montati in camere cellulari. Dopo il caricamento con l’indicatore del calcio (Cal-520 AM), l’imaging vivo di calcio può essere eseguito utilizzando la microscopia confocale a una lunghezza d’onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 510-520 nm.

Il metodo qui descritto è stato utilizzato per ottenere le prime misurazioni intracellulari del calcio dai periciti capillari cerebrali primari, dimostrando che i periciti sono stimolati tramite ATP e sono in grado di contrarsi in vitro.

Introduction

I periciti capillari cerebrali, insieme alle cellule endoteliali e agli astrociti, costituiscono l’NVU^1,2,3. Le cellule endoteliali, che formano la base strutturale dei capillari, formano lunghi tubi cilindrici con un diametro di 5-8 μm. Le cellule endoteliali sono sporadicamente coperte di periciti e circondate da sporgenze da astrociti; l’endfeet astrocita.

La barriera ematico-encefalica (BBB), situata ai capillari cerebrali, è il sito principale per lo scambio di nutrienti, gas e prodotti di scarto tra il cervello e il sangue. La BBB protegge anche il cervello dalle neurotossine endogene ed esogene e funge da barriera per la consegna di un gran numero di composti farmacologici. La funzione barriera è un’area di interesse, oltre che un ostacolo, per le aziende farmaceutiche che sviluppano farmaci del sistema nervoso centrale (SNC). Ciò ha suscitato un grande interesse nello studio delle cellule dell’NVU nella coltura⁴. Gli astrociti cerebrali e le cellule endoteliali sono stati coltivati e caratterizzati in una serie di studi, mentre gli studi e i protocolli per la coltura dei periciti sono scarsi.

Protocolli pubblicati in precedenza hanno descritto in una certa misura la generazione di colture di periciti capillari cerebrali, utilizzando una serie di approcci diversi come l’immunopanning^5,i mezzi ad alto e basso glucosio^6,lo smistamento cellulare attivato fluorescente^7,la centrifugazione del gradiente di^{densità 8,}ecc. Sebbene questi metodi sembrino sufficienti per ottenere colture di periciti, alcuni richiedono molto tempo, costano caro e i periciti ottenuti potrebbero non essere ideali a causa del numero di passaggi di coltura che possono dis differenziare i periciti⁹. Inoltre, il potenziale dei periciti coltivati negli studi di segnalazione in vitro è stato finora abbastanza inesplorato.

Il presente lavoro si concentra sulla generazione di colture di periciti da capillari cerebrali bovini isolati e sulla successiva configurazione per misurazioni e studi di imaging dei cambiamenti nel calcio intracellulare, un importante secondo messaggero intracellulare. Descriviamo brevemente l’isolamento dei capillari dalla materia grigia corticale (per i dettagli vedi Helms et al.¹⁰) e l’isolamento e la coltura dei periciti in pura monocoltura senza contaminazione con cellule endoteliali o gliali. Forniamo quindi un protocollo per la semina di periciti in piastre da 96 porcili e protocolli di carico per la sonda di calcio Fura-2 AM. Infine, mostriamo come i periciti possono essere utilizzati nell’imaging confocale in tempo reale nelle camere di coltura del microscopio e descriviamo i protocolli per questo.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e soluzioni per la coltivazione cellulare Preparare la soluzione di stock di collagene sciogliendo 5 mg di collagene IV dalla placenta umana in 50 mL di PBS durante la notte a 4 °C. Aliquota la soluzione stock in porzioni da 5 mL e conservare a -20 °C. Preparare la soluzione di stock di fibronectina sciogliendo 5 mg di fibronectina in 5 mL di acqua sterile durante la notte. Conservare le scorte di fibronectina in aliquote di 500 μL a -20 °C. Durante lo scongelamento, a…

Representative Results

I capillari cerebrali bovini sono stati isolati dal tessuto cerebrale fresco e la figura 1 presenta la semina capillare e la crescita cellulare nel corso dei giorni e la successiva purificazione dei periciti. I capillari sono completamente attaccati al pallone al giorno 1 e il giorno 2 la germogliazione endoteliale è diventata visibile(Figura 1, giorno 2). Dopo 4 giorni, la crescita cellulare è altamente distintiva<strong class…

Discussion

In questo studio, abbiamo presentato un metodo per isolare i periciti primari dal cervello dei bovini. Il protocollo descritto consente impostazioni cultura di questo tipo di cella altrimenti piuttosto inaccessibile. La successiva coltura cellulare ottenuta era una popolazione quasi omogenea di periciti, con poca o nessuna contaminazione con cellule endoteliali e cellule gliali basate sulla morfologia cellulare e sull’espressione proteica^12. Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo semplice e diretto…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603