Kultur av hjernekapillære pericytter for cytosoliske kalsiummålinger og kalsiumavbildningsstudier

Summary

Hjernekapillære pericytes er essensielle aktører i reguleringen av blod-hjerne barriere egenskaper og blodstrøm. Denne protokollen beskriver hvordan hjernekapillære pericytes kan isoleres, kultiveres, karakteriseres med hensyn til celletype og brukes til undersøkelser av intracellulær kalsiumsignalering med fluorescerende sonder.

Abstract

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytisk endfeet i en struktur kjent som den nevrovaskulære enheten (NVU). Hjernekapillær perikyttfunksjon er ikke fullt kjent. Pericytes har blitt foreslått å være involvert i kapillær utvikling, regulering av endotelbarriere tetthet og trancytose aktivitet, regulering av kapillær tone og å spille avgjørende roller i visse hjernepatologier.

Pericytes er utfordrende å undersøke i den intakte hjernen på grunn av vanskelighetene med å visualisere prosesser i hjernen parenchyma, samt nærhet til de andre cellene i NVU. Den nåværende protokollen beskriver en metode for isolasjon og kultur av primære storfe hjernekapillær pericytes og deres følgende bruk i kalsiumavbildningsstudier, hvor effekter av agonister involvert i hjernesignalering og patologier kan undersøkes. Kortikale kapillære fragmenter får lov til å feste seg til bunnen av kulturflasker, og etter 6 dager har endotelceller og pericytes vokst ut fra kapillære fragmenter. Endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering og pericytter dyrkes i 5 ekstra dager før passaging.

Isolerte pericytter er seeded i 96-brønns kulturplater og lastet med kalsiumindikatorfargestoff (Fura-2 acetoksymetyl (AM)) for å tillate målinger av intracellulære kalsiumnivåer i et plateleseroppsett. Alternativt er pericytes seeded på dekkglass og montert i cellekamre. Etter lasting med kalsiumindikatoren (Cal-520 AM), kan kalsium live-imaging utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved en eksitasjon bølgelengde på 488 nm og utslipp bølgelengde på 510-520 nm.

Metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å oppnå de første intracellulære kalsiummålingene fra primære hjernekapillære perikytter, som viser at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til å trekke in vitro sammen.

Introduction

Hjernekapillære pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, utgjør NVU^1,2,3. Endotelcellene, som danner det strukturelle grunnlaget for kapillærene, danner lange sylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellene er sporadisk dekket med pericytter og omgitt av fremspring fra astrocytter; astrocyttendehennetten.

Blod-hjernebarrieren (BBB), som ligger ved hjernens kapillærer, er hovedstedet for utveksling av næringsstoffer, gasser og avfallsprodukter mellom hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mot endogene og eksogene nevrotoksiner og fungerer som en barriere for levering av et stort antall legemiddelforbindelser. Barrierefunksjonen er et fokusområde, samt et hinder, for legemiddelselskaper som utvikler sentralnervesystemet (CNS) medisiner. Dette har ansporet en stor interesse i å undersøke cellene i NVU i kultur⁴. Hjerneastrocytter og endotelceller har blitt dyrket og karakterisert i en rekke studier, mens studier og protokoller for perikyttkultur er sparsomme.

Tidligere publiserte protokoller har beskrevet generering av hjernekapillærpericyte kulturer til en viss grad, ved hjelp av en rekke forskjellige tilnærminger som immunopanning^5,høy- og lav-glukose media⁶, fluorescerende-aktivert celle sortering⁷, tetthet gradient sentrifugering⁸, etc. Selv om disse metodene synes tilstrekkelig til å oppnå kulturer av pericytes, noen er tidkrevende, koster dyrt og pericytes oppnådd kan ikke være ideelt på grunn av antall kulturpassasjer som kan de-differensiere pericytes⁹. Videre har potensialet for kultiverte pericytter i in vitro signalstudier vært ganske uutforsket til nå.

Det nåværende arbeidet fokuserer på generering av pericytekulturer fra isolerte storfe hjernekapillærer og det påfølgende oppsettet for målinger og bildestudier av endringer i intracellulær kalsium, en viktig intracellulær andre budbringer. Vi beskriver kort isolasjonen av kapillærer fra kortikal grå materie (for detaljer se Helms et al.¹⁰) og isolasjon og kultur av pericytes i ren monokultur uten forurensning med endotel- eller glialceller. Vi gir deretter en protokoll for såing av pericytes i 96-brønnsplater og lasteprotokoller for kalsiumsonden Fura-2 AM. Til slutt viser vi hvordan pericytes kan brukes i sanntid confocal imaging i mikroskop kulturkamre og beskrive protokollene for dette.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og løsninger for celle culturing Forbered kollagen lagerløsning ved å oppløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS over natten ved 4 °C. Aliquot lagerløsningen i 5 ml porsjoner og lagre ved -20 °C. Forbered fibronectin lageroppløsning ved å oppløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vann over natten. Oppbevar fibronectinbestandene i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Når du tiner, legg PBS til et endelig volum på 50 ml for å klargjøre arbeidsløsningen…

Representative Results

Storfe hjernekapillærer ble isolert fra friskt hjernevev og figur 1 presenterer kapillær såing og cellulær utvekst over dager og påfølgende rensing av pericytes. Kapillærene er helt festet til kolben på dag 1, og på dag 2 har endotelspirering blitt synlig (figur 1, dag 2). Etter 4 dager er cellulær utvekst svært særegen (figur 1, dag 4a) og endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering s…

Discussion

I denne studien har vi presentert en metode for å isolere primære pericytter fra storfehjerner. Den beskrevne protokollen tillater kultur av denne ellers ganske utilgjengelig celletype. Den senere oppnådde cellekulturen var en nesten homogen populasjon av pericytter, med liten eller ingen forurensning med endotelceller og glialceller basert på cellemorfologi og proteinuttrykk¹². Videre demonstrerte vi en enkel og grei metode for å laste pericytene med kalsiumfargestoffer for Ca^{2 +}-…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603