चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण
Summary
अलग आरएनए की शुद्धता और अखंडता आरएनए निर्भर परख में एक महत्वपूर्ण कदम है । यहां, हम अक्षतिग्रस्त अग्नाशय के ऊतकों की एक छोटी मात्रा से आरएनए निकालने के लिए एक व्यावहारिक, तेजी से और सस्ती विधि पेश करते हैं।
Abstract
निष्कर्षण विधि के बावजूद, ऊतकों और सेल लाइनों का अनुकूलित आरएनए निष्कर्षण चार चरणों में किया जाता है: 1) समरूपता, 2) आरएनए से प्रोटीन का प्रभावी विकृति, 3) राइबोन्यूलाइज निष्क्रियता, और 4) डीएनए, प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट से संदूषण को हटाना। हालांकि, जब ऊतक में आरएनएएस के उच्च स्तर होते हैं तो आरएनए की अखंडता को बनाए रखना बहुत श्रमसाध्य होता है। सहज ऑटोलिसिस इसे नुकसान पहुंचाए बिना अग्नाशय के ऊतकों से आरएनए निकालने के लिए बहुत मुश्किल बना देता है। इस प्रकार, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान अग्नाशय के ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने के लिए एक व्यावहारिक आरएनए निष्कर्षण विधि की आवश्यकता होती है। मौजूदा प्रोटोकॉल का एक प्रयोगात्मक और तुलनात्मक अध्ययन 2 मिनट से भी कम समय में चूहा अग्नाशय के ऊतकों के 20-30 मिलीग्राम प्राप्त करने और आरएनए निकालने के द्वारा किया गया था । परिणामों का आकलन इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया । परिणामों के सामान्यीकरण के लिए तीन बार प्रयोग किए गए । आरएनए स्थिरीकरण रिएजेंट में अग्नाशय के ऊतकों को विसर्जित करना -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए उच्च अखंडता आरएनए, जब आरएनए निष्कर्षण अभिवाक्त्रक को रिएजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्राप्त परिणाम स्पिन कॉलम बाइंडिंग के साथ वाणिज्यिक किट से प्राप्त परिणामों के बराबर थे।
Introduction
संरचनात्मक जीन डेटा जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से एक कार्यात्मक उत्पाद के लिए लिखित किया जा सकता है । आरएनए विश्लेषण का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों को खोजने के लिए किया जाता है। न्यूक्लियिक एसिड निकालने के लिए कई तरीके हैं: ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट, फिनोल-क्लोरोफॉर्म, सेल्यूलोज आधारित क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से निष्कर्षण, सिलिका मैट्रिस द्वारा निष्कर्षण, और एनियन-एक्सचेंज1,,2।
जीन अभिव्यक्ति का उचित पता लगाना ऊतकों से अलग आरएनए की अखंडता से प्रभावित होता है; इसलिए, आगे के परीक्षणों से पहले ऊतकों से अलग आरएनए की अखंडता का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि कम गुणवत्ता वाले आरएनए पर पूरक आणविक परीक्षण नैदानिक आवेदन परिणामों को ख़तरे में डालना हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ आणविक जैविक परीक्षणों के लिए उच्च अखंडता आरएनए की आवश्यकता होती है: मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, माइक्रो-सरणी, राइबोन्यूलेज प्रोटेक्शन परख, उत्तरी दाग विश्लेषण, आरएनए मैपिंग, और सीडीएनए लाइब्रेरी निर्माण3,,4।
आरएनए एक लंबे समय के लिए रखा जा रहा है के बाद बल्कि अस्थिर हो जाता है । 10 केबी से अधिक लंबे एमआरएनए के टुकड़े विशेष रूप से5,6के क्षरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस प्रकार, शोधकर्ताओं को विभिन्न कारकों पर विचार करना चाहिए जो शुद्ध आरएनए की अखंडता को प्रभावित करते हैं। आरएनए की शुद्धता को आरएनएस, प्रोटीन, जीनोमिक डीएनए और एंजाइमेटिक अवरोधक संदूषण के खिलाफ संरक्षित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यूवी (260/280) के लिए आरएनए का सबसे अच्छा और स्वीकार्य अवशोषण अनुपात इलेक्ट्रोफोरेसिस पर न्यूनतम विखंडन के साथ 1.8-2.0 की सीमा के भीतर होना चाहिए । हाल ही में विकसित प्रयोगशाला तकनीकों ने वैज्ञानिकों को आणविक विश्लेषण नमूने की अखंडता का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाया है , जो व्यावहारिक रूप से7,8
राइबोन्यूक्लिस (आरएनएस) की उच्च मात्रा के कारण अन्य प्रकार के ऊतकों की तुलना में अग्नाशय के ऊतकों से अक्षतिग्रस्त आरएनए निकालना बहुत अधिक कठिन है। हालांकि, मौजूदा निष्कर्षण विधियों, अर्थात् पेट की गुहा से अग्नाशय के ऊतकों का तेजी से इंजेक्शन और कम तापमान पर समरूपता आरनासेस को बाधित करने के लिए, अप्रभावी,,7,8,9,10, 11,,,,,12,1113, 14साबित हुए हैं।,14
वर्तमान तुलनात्मक प्रयोगात्मक अध्ययन का उद्देश्य सबसे कुशल तरीकों को निर्धारित करने के लिए मौजूदा तरीकों को संशोधित करना और तुलना करना है। इस उद्देश्य के लिए, आरएनए निष्कर्षण के विभिन्न प्रोटोकॉलों को संशोधित किया गया था और इसकी तुलना की गई थी। यह विशेष रूप से अग्नाशय के ऊतकों की एक ंयूनतम राशि की आवश्यकता होती है कम से कम महंगी विधि का निर्धारण करने के उद्देश्य से किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
आणविक जीव विज्ञान में उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं और ऊतकों में राइबोन्यूक्लिज एंजाइमों की उपस्थिति जल्दी से आरएनए को नीचा दिखाती है और निष्कर्षण जटिल बनाती है। RNases ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान अध्ययन को शिराज आयुर्विज्ञान विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या 93-01-01-7178\03-07-2014) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था । हम वीडियो के संपादन के लिए ई-लर्निंग इन मेडिकल साइंसेज, वर्चुअल स्कूल और सेंटर ऑफ एक्सीलेंस इन ई-लर्निंग, शिराज यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिकल साइंसेज में श्री जोमोरोडियन और श्री रोस्टामी को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
Riferimenti
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