Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv
Summary
Renheden og integriteten af det isolerede RNA er et afgørende skridt i RNA-afhængige analyser. Her præsenterer vi en praktisk, hurtig og billig metode til at udtrække RNA fra en lille mængde ubeskadiget pancreas væv.
Abstract
Uanset ekstraktionsmetoden udføres optimeret RNA-ekstraktion af væv og cellelinjer i fire faser: 1) homogenisering, 2) effektiv denaturering af proteiner fra RNA, 3) ribonuclease inaktivering og 4) fjernelse af forurening fra DNA, proteiner og kulhydrater. Men det er meget besværligt at opretholde integriteten af RNA, når der er høje niveauer af RNase i vævet. Spontan autolyse gør det meget vanskeligt at udtrække RNA fra pancreas væv uden at beskadige det. Således, en praktisk RNA ekstraktion metode er nødvendig for at opretholde integriteten af pancreas væv under ekstraktionsprocessen. En eksperimentel og sammenlignende undersøgelse af eksisterende protokoller blev udført ved at opnå 20-30 mg rotte pancreas væv i mindre end 2 minutter og udvinde RNA. Resultaterne blev vurderet ved elektroforese. Forsøgene blev udført tre gange med hensyn til generalisering af resultaterne. Nedsænkning pancreas væv i RNA stabilisering reagens ved -80 °C i 24 h gav høj integritet RNA, når RNA ekstraktion reagens blev brugt som reagens. De opnåede resultater var sammenlignelige med resultaterne fra kommercielle kits med spin kolonne bindinger.
Introduction
Strukturelle gendata kan transskriberes til et funktionelt produkt gennem genekspression. RNA-analyse bruges til at opdage forskelle i genekspression på tværs af forskellige forhold. Der findes en række metoder til ekstraktion af nukleinsyrer som følger: guanidinium thiocyanat, ekstraktion via phenol-chloroform, cellulosebaseret kromatografi, ekstraktion af silicamatrater og anionudveksling1,2.
Korrekt påvisning af genekspression påvirkes af RNA’s integritet isoleret fra væv; Derfor er det vigtigt at evaluere integriteten af RNA isoleret fra væv, før yderligere test udføres, fordi supplerende molekylære test på lav kvalitet RNA kan bringe diagnostiske applikationsresultater. Således høj integritet RNA er nødvendig for molekylære biologiske tests med forskellige diagnostiske anvendelser: kvantitative RT-PCR, mikro-arrays, ribonuclease beskyttelse assay, nordlige blot analyse, RNA kortlægning, og cDNA bibliotek konstruktion3,4.
RNA bliver temmelig ustabil efter at være blevet holdt i lang tid. Lange mRNA-fragmenter over 10 kb er særligt modtagelige fornedbrydning 5,6. Således, forskere skal overveje forskellige faktorer, der påvirker integriteten af renset RNA. Renheden af RNA skal beskyttes mod RNases, proteiner, genomisk DNA og enzymatisk inhibitorforurening. Desuden skal det bedste og acceptable absorptionsforhold RNA til UV (260/280) være inden for intervallet 1,8-2,0 med minimal fragmentering over elektroforese. Nyligt udviklede laboratorieteknikker har gjort det muligt for forskerne at vurdere integriteten af den molekylære analyseprøve merepraktisk 7,8.
Det er meget vanskeligere at udtrække ubeskadiget RNA fra pancreas væv end andre typer af væv på grund af den høje mængde af ribonukleaser (RNases). Men, eksisterende ekstraktionsmetoder, nemlig den hurtige udslyngning af bugspytkirtlen væv fra bughulen og homogenisering ved lave temperaturer for at hindre RNases, har vist sigineffektiv 7,8,,9,,10,11,12,13,14.
Formålet med denne sammenlignende forsøgsundersøgelse er at ændre og sammenligne eksisterende metoder til bestemmelse af de mest effektive metoder. Med henblik herpå blev forskellige protokoller for RNA-ekstraktion ændret og sammenlignet. Det var specifikt rettet mod bestemmelse af den billigste metode, der kræver et minimum af pancreas væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
I molekylærbiologi er det vigtigt at opnå RNA af høj kvalitet. Tilstedeværelsen af ribonucleaseenzymer i celler og væv nedbryder hurtigt RNA og gør ekstraktionskomplekset. RNases er stabile enzymer, der fungerer uden co-faktorer. Små mængder RNase er tilstrækkelige til at ødelægge RNA. Når rotte pancreas væv fjernes fra bughulen, er det nødvendigt at desinficere de kirurgiske instrumenter ved stærke rengøringsmidler, skylle dem grundigt og læg dem i en ovn i mindst 4 timer ved 240 °C for at inaktivere R…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet økonomisk af Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Vi takker Mr. Zomorodian og Mr. Rostami på Institut for e-Learning i Medical Sciences, Virtual School og Center of Excellence i e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences for redigering af videoen.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
Riferimenti
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
