Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu
Summary
İzole Edilmiş RNA’nın saflığı ve bütünlüğü, RNA’ya bağlı tahlillerde hayati bir adımdır. Burada, hasarsız pankreas dokusunun küçük bir miktar RNA ayıklamak için pratik, hızlı ve ucuz bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Ekstraksiyon yöntemine bakılmaksızın, doku ların ve hücre hatlarının optimize edilmiş RNA ekstraksiyonu dört aşamada gerçekleştirilir: 1) homojenizasyon, 2) Proteinlerin RNA’dan etkili denatürasyonu, 3) ribonükleaz inaktivasyonu ve 4) DNA, protein ve karbonhidratlardan kontaminasyonun çıkarılması. Ancak, dokuda yüksek rnase düzeyleri olduğunda RNA bütünlüğünü korumak için çok zahmetli. Spontan otolsis çok zor pankreas dokusundan rna zarar vermeden ayıklamak için yapar. Böylece, pratik bir RNA ekstraksiyon yöntemi çıkarma işlemi sırasında pankreas dokularının bütünlüğünü korumak için gereklidir. Mevcut protokollerin deneysel ve karşılaştırmalı bir çalışma az 2 dakika içinde sıçan pankreas dokularının 20-30 mg elde edilmesi ve RNA ayıklanması ile yapılmıştır. Sonuçlar elektroforez ile değerlendirildi. Deneyler sonuçların genelleştirilmesi için üç kez yapılmıştır. 24 saat için -80 °C’de RNA stabilizasyon reaktifine pankreas dokusu nun daldırılması, RNA ekstraksiyon reaktifi reaktif olarak kullanıldığında yüksek bütünlüklü RNA’ya neden oldu. Elde edilen sonuçlar spin kolon bağlamaları ile ticari kitlerden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir.
Introduction
Yapısal gen verileri gen ekspresyonu yoluyla fonksiyonel bir ürüne aktarılabilir. RNA analizi farklı koşullar arasında gen ekspresyonu farklılıkları keşfetmek için kullanılır. Aşağıdaki gibi nükleik asitleri ayıklamak için yöntemler vardır: guanidinium tiyosiyanat, fenol-kloroform ile ekstraksiyon, selüloz bazlı kromatografi, silika matrisler tarafından ekstraksiyon, ve anyon değişimi1,2.
Gen ekspresyonunun doğru saptanması dokulardan izole edilen RNA’nın bütünlüğünden etkilenir; bu nedenle, düşük kaliteli RNA üzerinde tamamlayıcı moleküler testler tanısal uygulama sonuçlarını tehlikeye atabileceğinden, ileri testler yapılmazken dokulardan izole edilen RNA’nın bütünlüğünün değerlendirilmesi hayati önem taşımaktadır. Böylece, yüksek bütünlük RNA farklı tanı uygulamaları ile moleküler biyolojik testler için gereklidir: kantitatif RT-PCR, mikro-diziler, ribonuklez koruma testi, kuzey leke analizi, RNA haritalama, ve cDNA kütüphane inşaat3,4.
RNA uzun süre tutulduktan sonra oldukça kararsız hale gelir. 10 kb üzerindeki uzun mRNA parçaları özellikle 55,6bozulmasına duyarlıdır. Bu nedenle, araştırmacılar arınmış RNA bütünlüğünü etkileyen çeşitli faktörler dikkate almalıdır. RNA saflığı RNa’lara, proteinlere, genomik DNA’ya ve enzimatik inhibitör kontaminasyonuna karşı korunmalıdır. Buna ek olarak, RNA’nın UV’ye (260/280) en iyi ve kabul edilebilir emilim oranı elektroforez üzerinde minimum parçalanma ile 1.8-2.0 aralığında olmalıdır. Son zamanlarda geliştirilen laboratuvar teknikleri bilim adamları daha pratik 77,8moleküler analiz örnek bütünlüğünü değerlendirmek için sağlamıştır.
Bu ribonükleazların yüksek miktarda nedeniyle dokuların diğer türleri daha pankreas dokusundan hasarsız RNA ayıklamak çok daha zordur (RNas). Ancak, mevcut ekstraksiyon yöntemleri, yani karın boşluğundan pankreas dokusunun hızlı ejeksiyon ve düşük sıcaklıklarda homojenizasyon RNases engellemek için, etkisizolduğukanıtlanmıştır 7 ,8,,9,10,11,12,13,14.
Bu karşılaştırmalı deneysel çalışmanın amacı, en verimli yöntemleri belirlemek için mevcut yöntemleri değiştirmek ve karşılaştırmaktır. Bu amaçla, RNA çıkarma çeşitli protokolleri değiştirildi ve karşılaştırıldı. Özellikle pankreas dokusunun minimum miktarda gerektiren en pahalı yöntemi belirlemeamaçlıydı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moleküler biyolojide yüksek kaliteli RNA elde etmek hayati önem taşımaktadır. Hücre ve dokularda ribonükleaz enzimlerin varlığı hızla RNA düşürür ve ekstraksiyon karmaşık hale getirir. RNases herhangi bir co-faktör olmadan çalışan kararlı enzimler vardır. Az miktarda RNa RNA’yı yok etmek için yeterlidir. Fare pankreas dokusu karın boşluğundan çıkarıldığında, cerrahi aletleri güçlü deterjanlarla dezenfekte etmek, iyice durulamak ve ameliyattan önce RNases’i inaktive etmek için 240 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Şiraz Tıp Bilimleri Üniversitesi tarafından mali olarak desteklenmiştir (Hibe No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Biz E-Tıp Bilimleri, Sanal Okul ve Mükemmellik Merkezi e-Öğrenme Bölümü’ nde Sayın Zomorodian ve Bay Rostami teşekkür e-Öğrenme, Şiraz Üniversitesi Tıp Bilimleri video düzenleme için.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
Riferimenti
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
