Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv
Summary
Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.
Abstract
Neurofilament-Proteinpolymere bewegen sich entlang von Axonen in der langsamen Komponente des axonalen Transports bei Durchschnittsgeschwindigkeiten von 0,35-3,5 mm/Tag. Bis vor kurzem war die Untersuchung dieser Bewegung vor Ort nur mit radioisotopischer Pulsbeschriftung möglich, die eine Analyse des axonalen Transports in ganzen Nerven mit einer zeitlichen Auflösung von Tagen und einer räumlichen Auflösung von Millimetern ermöglicht. Um den Neurofilamenttransport vor Ort mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, haben wir eine hThy1-paGFP-NFM transgene Maus entwickelt, die Neurofilamentprotein M mit photoaktivierbarem GFP in Neuronen ausdrückt. Hier beschreiben wir Fluoreszenz-Photoaktivierung Puls-Escape und Puls-Spread-Methoden zur Analyse des Neurofilamenttransports in einzelnen myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen ex vivo. Isolierte Nervensegmente werden auf der Mikroskopstufe durch Perfusion mit sauerstoffhaltiger Saline erhalten und durch drehende Plattenkonfokaleszenzmikroskopie abgebildet. Violettes Licht wird verwendet, um die Fluoreszenz in einem kurzen axonalen Fenster zu aktivieren. Die Fluoreszenz in den aktivierten und flankierenden Regionen wird im Laufe der Zeit analysiert, was die Untersuchung des Neurofilamenttransports mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in der Größenordnung von Minuten bzw. Mikrometern ermöglicht. Mathematische Modellierung kann verwendet werden, um kinetische Parameter des Neurofilamenttransports einschließlich der Geschwindigkeit, der Richtungsverzerrung und des Pausungsverhaltens aus den resultierenden Daten zu extrahieren. Die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden können auch angepasst werden, um den Neurofilamenttransport in anderen Nerven zu visualisieren. Mit der Entwicklung zusätzlicher transgener Mäuse könnten diese Methoden auch verwendet werden, um den axonalen Transport anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine in Axonen abzubilden und zu analysieren.
Introduction
Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung1demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls2. Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie in den 1990er Jahren wurde es später möglich, neurofilamenten Transport direkt in kultivierten Neuronen auf einer Zeitskala von Sekunden oder Minuten und mit Submikrometer räumlicher Auflösung abzubilden, was einen viel größeren Einblick in den Mechanismus der Bewegung3ermöglichte. Diese Studien haben gezeigt, dass Neurofilamentpolymere in Axonen sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen entlang von Mikrotubulispuren, angetrieben von mikrotubule motorischen Proteinen, schnell und intermittierend bewegen. Neurofilamente sind jedoch beugungsbegrenzte Strukturen mit einem Durchmesser von nur 10 nm, die in der Regel nur um zig Nanometer von ihren Nachbarn entfernt sind; Daher können die Polymere nur in kultivierten Neuronen verfolgt werden, die dünn verteilte Neurofilamente enthalten, so dass die beweglichen Polymere von ihren Nachbarn gelöst werden können4. Daher ist es derzeit nicht möglich, einzelne Neurofilamente in Axonen zu verfolgen, die reichlich Neurofilamentpolymere enthalten, wie z. B. myelinierte Axone.
Um den axonalen Transport von Neurofilamenten in neurofilamentreichen Axonen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden wir eine fluoreszenz-Photoaktivierungs-Puls-Escape-Methode, die wir entwickelt haben, um das langfristige Pausungsverhalten von Neurofilamenten in kultivierten Nervenzellen4,5zu untersuchen. Neurofilamente, die mit einem photoaktivierbaren fluoreszierenden Neurofilament-Fusionsprotein markiert sind, werden in einem kurzen Segment von Axon aktiviert, und dann wird die Abflugrate dieser Filamente aus der aktivierten Region durch Messung des Fluoreszenzzerfalls im Laufe der Zeit quantifiziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es sich um eine Populations-Level-Analyse des Neurofilamenttransports handelt, die auf einer Zeitskala von Minuten oder Stunden angewendet werden kann, ohne die Bewegung einzelner Neurofilamentpolymere verfolgen zu müssen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Kinetik des Neurofilamenttransports in myelinierenden Kulturen zu analysieren6.
Kürzlich beschrieben wir die Entwicklung einer hThy1-paGFP-NFM transgenen Maus, die niedrige Konzentrationen eines paGFP-markierten Neurofilament-Proteins M (paGFP-NFM) in Neuronen unter der Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Thy1-Promotors7ausdrückt. Diese Maus ermöglicht die Analyse des Neurofilamenttransports in situ mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Ansätze zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen mit zwei Ansätzen. Der erste dieser Ansätze ist die oben beschriebene Puls-Escape-Methode. Diese Methode kann Informationen über das Pausungsverhalten der Neurofilamente generieren, ist aber blind für die Richtung, in der die Filamente den aktivierten Bereich abfahren, und erlaubt daher keine Messung der Nettorichtung und Transportgeschwindigkeit8. Der zweite dieser Ansätze ist eine neue Puls-Spread-Methode, bei der wir nicht nur den Verlust der Fluoreszenz aus der aktivierten Region analysieren, sondern auch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz in zwei flankierenden Fenstern, durch die sich die fluoreszierenden Filamente bewegen, während sie den aktivierten Bereich sowohl anterograde als auch retrograde Richtungen ablassen. In beiden Ansätzen können Parameter des Neurofilamenttransports wie Durchschnittsgeschwindigkeit, Nettorichtungund Pausierungsverhalten durch mathematische Analyse und Modellierung der Fluoreszenzveränderungen in den Messfenstern ermittelt werden. Abbildung 3 zeigt diese beiden Ansätze.
Dieses Protokoll demonstriert die Zerlegung und Vorbereitung des Nervs, Aktivierung und Bildgebung der paGFP Fluoreszenz, und Quantifizierung des Neurofilament-Transports aus den erfassten Bildern mit dem FIJI-Verteilungspaket von ImageJ9. Wir verwenden den Tibianerv, weil er lang ist (mehrere cm) und nicht verzweigt; Grundsätzlich ist jedoch jeder Nervenausdruck paGFP-NFM für die Verwendung mit dieser Technik geeignet, wenn es seziert und entmantelt werden kann, ohne die Axone zu beschädigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der Analyse von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten ist Vorsicht geboten, da ein erhebliches Potenzial für die Einschleppung von Fehlern während der Nachbearbeitung, vor allem während der Flachfeldkorrektur, Bildausrichtung und Bleichkorrektur, besteht. Die Flachfeldkorrektur ist notwendig, um die Ungleichmäßigkeit in der Beleuchtung zu korrigieren, was zu einem Rückgang der Intensität über das Sichtfeld von der Mitte zur Peripherie führt. Das Ausmaß der Ungleichmäßigkeit ist wellenlängenabhängig …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Paula Monsma für die Unterweisung und Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und tibialen Nervensektion und Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger und Sana Chahande für die Unterstützung bei der Maushaltung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die kollaborativen National Science Foundation Grants IOS1656784 an A.B. unterstützt. und IOS1656765 an P.J., und National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 und S10 OD010383 an A.B. N.P.B. wurde durch ein Stipendium des Postdoctoral Scholars Program der Ohio State University unterstützt.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Riferimenti
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