הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised
Summary
אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.
Abstract
פולימרים חלבון Neurofilament לנוע לאורך אקסונים ברכיב איטי של תחבורה אקסונלית במהירויות ממוצעות של ~ 0.35-3.5 מ”מ ליום. עד לאחרונה המחקר של תנועה זו ב situ היה אפשרי רק באמצעות תיוג דופק רדיואיזוטופי, המאפשר ניתוח של תחבורה אקסונלית בעצבים שלמים עם רזולוציה זמנית של ימים ורזולוציה מרחבית של מילימטרים. כדי ללמוד תחבורה neurofilament בסיטו עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה יותר, פיתחנו עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא חלבון neurofilament M מתויג עם GFP פוטואקטיבית בנוירונים. כאן אנו מתארים פלואורסץ פוטו-הפעלה פולס-לברוח ושיטות התפשטות דופק לנתח תחבורה neurofilament באקסונים מיאליים יחיד של עצבי השוקה מעכברים אלה ex vivo. קטעי עצב מבודדים נשמרים על שלב המיקרוסקופ על ידי עירוי עם תמיסת מלח מחומצנת ותמונה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנס דיסק ספינוד ספינוד. אור סגול משמש להפעלת הפלואורסצנס בחלון קצר. הפלואורסצינטיות באזורים הפעילים והמאגפים מנותחת לאורך זמן, מה המאפשר את המחקר של תעבורת נוירופילמנט עם רזולוציה זמנית ומרחבית בסדר של דקות ומיקרונים, בהתאמה. מידול מתמטי יכול לשמש כדי לחלץ פרמטרים קינטיים של תעבורת neurofilament כולל המהירות, הטיה כיוונית והתנהגות ההשהיה מהנתונים המתווברים. שיטות הבריחה הדופק והתפשטות הדופק ניתן גם להתאים כדי לדמיין את התחבורה neurofilament בעצבים אחרים. עם התפתחותם של עכברים טרנסגניים נוספים, שיטות אלה יכול לשמש גם כדי למצוא תמונה ולנתח את ההובלה האקסונלית של חלבונים ציטוסקאלטיים וציטוסוליים אחרים באקסונים.
Introduction
הטרנספורט האקסונלי של neurofilaments הוכח לראשונה בשנות ה-70 על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי1. גישה זו הניבה שפע של מידע על תחבורה neurofilament ב vivo, אבל יש לו רזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה יחסית, בדרך כלל על סדר של מילימטרים וימים במקרההטוב 2. יתר על כן, תיוג דופק רדיואיזוטופי היא גישה עקיפה הדורשת הזרקה והקרבה של בעלי חיים מרובים כדי ליצור קורס זמן יחיד. עם הגילוי של חלבוני פלורסנט והתקדמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנות ה-90, לאחר מכן זה הפך להיות אפשרי לתעבורת neurofilament תמונה ישירות נוירונים תרבותיים בקנה מידה של שניות או דקות עם רזולוציה מרחבית תת מיקרומטר, מתן תובנה הרבה יותר גדולה לתוך מנגנוןתנועה 3. מחקרים אלה גילו כי פולימרים neurofilament באקסונים לנוע במהירות לסירוגין הן anterograde ו לאחור כיוונים לאורך מסלולים microtubule, מונע על ידי חלבונים מוטוריים microtubule. עם זאת, neurofilaments הם מבנים מוגבלים iffraction רק 10 ננומטר קוטר כי הם בדרך כלל רווחים מלבד שכניהם על ידי עשרות ננומטר בלבד; לכן, הפולימרים ניתן לעקוב רק נוירונים תרבותיים המכילים neurofilaments מופץ דלילה, כך פולימרים נעים ניתן לפתור משכניהם4. לכן, זה לא אפשרי כיום לעקוב אחר neurofilaments יחיד באקסונים המכילים פולימרים neurofilament בשפע, כגון אקסונים מילינציה.
כדי לנתח את התחבורה האקסונלית של neurofilaments באקסונים עשירים neurofilament באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנטית, אנו משתמשים בשיטת פלומת פעולה פלואורסצנטית שפיתחנו כדי ללמוד את התנהגות השהיה לטווח ארוך של neurofilamentsבתאי עצב מתואורים 4,,5. Neurofilaments מתויג עם חלבון היתוך נוירופילמנט פלואורסצנטי פוטואקטיבי מופעלים בקטע קצר של axon, ולאחר מכן קצב היציאה של נטים אלה מהאזור הפעיל הוא מכמת על ידי מדידת ריקבון פלואורסצנטי לאורך זמן. היתרון של גישה זו הוא שזה ניתוח ברמת האוכלוסייה של תחבורה neurofilament שניתן להחיל על זמן בקנה מידה של דקות או שעות ללא צורך לעקוב אחר התנועה של פולימרים neurofilament בודדים. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את הקינטיקה של תעבורת neurofilament בתרבויות מדליה6.
לאחרונה, תיארנו את הפיתוח של עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא רמות נמוכות של חלבון neurofilament מתויג paGFP M (paGFP-NFM) בנוירונים תחת שליטתו של הנוירון האנושי ספציפי Thy1מקדם 7. עכבר זה מאפשר ניתוח של תחבורת neurofilament בסיטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ. במאמר זה, אנו מתארים את הגישות הניסיוניות לניתוח תעבורת neurofilament באקסונים מיאליים של עצבי טיביים מעכברים אלה באמצעות שתי גישות. הראשונה של גישות אלה היא שיטת הבריחה הדופק המתואר לעיל. שיטה זו יכולה ליצור מידע על התנהגות ההשהיה של neurofilaments, אבל הוא עיוור לכיוון שבו הנינים לעזוב את האזור מופעל, ולכן אינו מאפשר מדידה של כיווניות נטו ומהירותתחבורה 8. השנייה של גישות אלה היא שיטת התפשטות פולסים חדשה שבה אנו מנתחים לא רק את אובדן הפלואורסצנטי מהאזור הפעיל, אלא גם את העלייה ארעית בפלואורסצנטיות בשני חלונות איגוף שדרכה נעים הניאורים הפלואורסצנטיים כשהם יוצאים מהאזור הפעיל הן בכיוון אנטרולוגי והן בכיוון הנסיגה. בשתי הגישות, ניתן להשיג פרמטרים של תעבורת נוירופילמנט כגון המהירות הממוצעת, כיווניות נטו והתנהגות השהיה באמצעות ניתוח מתמטי ומידול של השינויים בפלואורסצנטיות בחלונות המדידה. איור 3 ממחיש את שתי הגישות הללו.
פרוטוקול זה מדגים את הניתוח וההכנה של העצב, ההפעלה וההדמיה של הפלואורסצנטיות paGFP, וכמת של תעבורת neurofilament מהתמונות שנרכשו באמצעות חבילת ההפצה FIJI של ImageJ9. אנו משתמשים בעצב הטיבי כי הוא ארוך (כמה ס”מ) ואינו מסתעף; עם זאת, באופן עקרוני כל עצב המביע paGFP-NFM מתאים לשימוש עם טכניקה זו אם ניתן לנתח אותו de-נדן מבלי לפגוע האקסונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנקוט טיפול בניתוח של ניסויי פעימה-בריחה והתפשטות פולסים, כי יש פוטנציאל משמעותי להקדמה של שגיאה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד, בעיקר במהלך תיקון שדה שטוח, יישור תמונה ותיקון אקונומיקה. תיקון שדה שטוח הכרחי כדי לתקן את אי אחידות התאורה, מה שופך לירידה בעוצמה על פני שדה הראייה ממרכז לפריפריה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות פאולה מונסמה על הדרכה וסיוע עם מיקרוסקופית confocal וניתוק עצב ים ד”ר Atsuko Uchida, קלואי דגר וסאנה Chahande לסיוע עם גידוך העכבר. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המדע הלאומית השיתופית Grants IOS1656784 ל-A.B. ו- IOS1656765 ל-P.J., והכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 NS038526, P30 NS104177 ו- S10 OD010383 ל-A.B. N.P.B. נתמכו על ידי מלגה מהתוכנית לחקר פוסט-טוטוריאלי של נשיא אוניברסיטת אוהיו.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Riferimenti
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscienze. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
