Avbildning og analyse av neurofilamenttransport i ekskisert mus tibial nerve
Summary
Vi beskriver fluorescensfotoaktiveringsmetoder for å analysere aksonal transport av nevrofilamenter i enkelt myelinerte aksler av perifere nerver fra transgene mus som uttrykker et fotoaktiverbart nevrofilamentprotein.
Abstract
Neurofilament protein polymerer beveger seg langs aksoner i den langsomme komponenten av aksonal transport ved gjennomsnittlige hastigheter på ~ 0,35-3,5 mm / dag. Inntil nylig var studien av denne bevegelsen in situ bare mulig ved hjelp av radioisotopisk pulsmerking, noe som tillater analyse av aksonal transport i hele nerver med en timelig oppløsning på dager og en romlig oppløsning på millimeter. For å studere nevrofilamenttransport in situ med høyere temporal og romlig oppløsning, utviklet vi en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrykker neurofilamentprotein M merket med fotoaktiverbar GFP i nevroner. Her beskriver vi fluorescens fotoaktivering puls-escape og puls-spredning metoder for å analysere neurofilament transport i enkelt myelinated aksoner av tibiale nerver fra disse musene ex vivo. Isolerte nervesegmenter opprettholdes på mikroskopstadiet ved perfusjon med oksygenert saltvann og avbildet ved å spinne diskkonokal fluorescensmikroskopi. Fiolett lys brukes til å aktivere fluorescensen i et kort aksonalt vindu. Fluorescensen i de aktiverte og flankerende regionene analyseres over tid, slik at studien av nevrofilamenttransport med timelig og romlig oppløsning i løpet av minutter og mikron, henholdsvis. Matematisk modellering kan brukes til å trekke ut kinetiske parametere for nevrofilamenttransport, inkludert hastighet, retningsbias og pauseatferd fra de resulterende dataene. Pulsflukt- og pulsspredningsmetodene kan også tilpasses for å visualisere nevrofilamenttransport i andre nerver. Med utviklingen av ytterligere transgene mus kan disse metodene også brukes til å bilde og analysere aksonal transport av andre cytoskeletale og cytosoliske proteiner i aksoner.
Introduction
Aksonal transport av nevrofilamenter ble først demonstrert på 1970-tallet av radioisotopisk pulsmerking1. Denne tilnærmingen har gitt et vell av informasjon om neurofilament transport in vivo, men den har relativt lav romlig og timelig oppløsning, vanligvis i rekkefølgen av millimeter og dager i bestefall 2. Videre er radioisotopisk pulsmerking en indirekte tilnærming som krever injeksjon og offer av flere dyr for å generere et enkelt tidskurs. Med oppdagelsen av fluorescerende proteiner og fremskritt i fluorescensmikroskopi på 1990-tallet, ble det senere mulig å bilde nevrofilamenttransport direkte i kultiverte nevroner på en tidsskala på sekunder eller minutter og med sub-mikrometer romlig oppløsning, noe som gir mye større innsikt ibevegelsesmekanismen 3. Disse studiene har vist at neurofilament polymerer i aksoner beveger seg raskt og midlertidig i både anterograde og retrograd retninger langs mikrotubuli spor, drevet av mikrotubuli motorproteiner. Imidlertid er nevrofilamenter diffraksjonsbegrensede strukturer bare 10 nm i diameter som vanligvis er fordelt bortsett fra sine naboer med bare titalls nanometer; Derfor kan polymerene bare spores i kultiverte nevroner som inneholder tynt fordelte nevrofilamenter slik at de bevegelige polymerene kan løses fra naboene4. Dermed er det for tiden ikke mulig å spore enkelt neurofilamenter i aksoner som inneholder rikelig nevrofilamentpolymerer, for eksempel myelinerte aksoner.
For å analysere aksonal transport av nevrofilamenter i neurofilamentrike aksoner ved hjelp av fluorescensmikroskopi, bruker vi en fluorescens fotoaktiveringspulsfluktmetode som vi utviklet for å studere den langsiktige pauseatferden til nevrofilamenter i kultiverte nerveceller4,5. Neurofilamenter merket med et fotoaktiverbart fluorescerende neurofilamentfusjonsprotein aktiveres i et kort segment av akson, og deretter kvantifiseres avgangshastigheten til disse filamentene fra den aktiverte regionen ved å måle fluorescensforfallet over tid. Fordelen med denne tilnærmingen er at det er en populasjonsnivåanalyse av nevrofilamenttransport som kan brukes på en tidsskala av minutter eller timer uten å måtte spore bevegelsen av individuelle nevrofilamentpolymerer. For eksempel har vi brukt denne metoden til å analysere kinetikken til nevrofilamenttransport i myelinerende kulturer6.
Nylig beskrev vi utviklingen av en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrykker lave nivåer av et paGFP-merket neurofilamentprotein M (paGFP-NFM) i nevroner under kontroll av den menneskelige nevron-spesifikke Thy1-promotoren7. Denne musen tillater analyse av neurofilament transport in situ ved hjelp av fluorescens mikroskopi. I denne artikkelen beskriver vi de eksperimentelle tilnærmingene for å analysere nevrofilamenttransport i myelinerte aksoner av tibiale nerver fra disse musene ved hjelp av to tilnærminger. Den første av disse tilnærmingene er pulsfluktmetoden beskrevet ovenfor. Denne metoden kan generere informasjon om pauseatferden til nevrofilamentene, men er blind for retningen der filamentene forlater den aktiverte regionen, og tillater derfor ikke måling av netto retningsbestemthet og transporthastighet8. Den andre av disse tilnærmingene er en ny pulsspredningsmetode der vi analyserer ikke bare tapet av fluorescens fra den aktiverte regionen, men også den forbigående økningen i fluorescens i to flankerte vinduer der fluorescerende filamenter beveger seg når de forlater den aktiverte regionen i både anterograde og retrograd retninger. I begge tilnærminger kan parametere for nevrofilamenttransport som gjennomsnittlig hastighet, netto retningsbestemthet og pauseatferd oppnås ved hjelp av matematisk analyse og modellering av endringene i fluorescens i målevinduene. Figur 3 illustrerer disse to tilnærmingene.
Denne protokollen demonstrerer disseksjon og utarbeidelse av nerve, aktivering og avbildning av paGFP fluorescens, og kvantifisering av neurofilament transport fra de oppkjøpte bildene ved hjelp av FIJI distribusjonspakke av ImageJ9. Vi bruker tibial nerve fordi den er lang (flere cm) og ikke gren; Men i prinsippet er enhver nerve som uttrykker paGFP-NFM egnet for bruk med denne teknikken hvis den kan dissekeres og de-sheathed uten å skade aksonene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det må tas hensyn til i analysen av pulsflukt- og pulsspredningseksperimenter fordi det er betydelig potensial for innføring av feil under etterbehandlingen, hovedsakelig under flatfeltkorreksjon, bildejustering og blekemiddelkorreksjon. Flatfeltkorreksjon er nødvendig for å korrigere for ikke-ensartethet i belysningen, noe som resulterer i et fall i intensitet over synsfeltet fra sentrum til periferi. Omfanget av ikke-ensartethet er bølgelengdeavhengig og bør derfor alltid utføres ved bølgelengden som skal bruke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Paula Monsma for instruksjon og hjelp med konokal mikroskopi og tibial nerve disseksjon og Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger og Sana Chahande for hjelp med mus husdyrhold. Dette arbeidet ble delvis støttet av samarbeidende National Science Foundation Grants IOS1656784 til A.B. og IOS1656765 til P.J., og National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 og S10 OD010383 til A.B. N.P.B. ble støttet av et fellesskap fra Ohio State University President’s Postdoctoral Scholars Program.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Riferimenti
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscienze. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
