En protokol til undersøgelse af biologisk væv ved høj rumlig opløsning ved hjælp af ultra-højt felt magnetisk resonansmikroskopi (MRM) ved hjælp af mikrokoil præsenteres. Trin-for-trin instruktioner er fastsat for at karakterisere mikrokoiler. Endelig er optimering af billeddannelse demonstreret på planterødder.
Denne protokol beskriver en signal-støj-kalibrering (SNR) kalibrering og prøveforberedelsesmetode for magnetmikrosiler kombineret med biologiske prøver, der er designet til magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) med høj opløsning (MRI), også kaldet MR-mikroskopi (MRM). Det kan anvendes ved prækliniske MR-spektrometre, demonstreret på Medicago truncatula rodprøver. Mikrokospoler øger følsomheden ved at matche RF-resonatorens størrelse med størrelsen af den stikprøve, der er af interesse, hvilket muliggør højere billedopløsninger i en given dataindsamlingstid. På grund af det relativt enkle design er solenoidal mikrokoil ligetil og billige at konstruere og kan nemt tilpasses prøvekravene. Systematisk forklarer vi, hvordan man kalibrerer nye eller hjemmebyggede mikrokospoler ved hjælp af en referenceløsning. Kalibreringstrinnene omfatter: bestemmelse af impulseffekt ved hjælp af en nøddebue; skøn over homogeniteten i RF-feltet og beregning af et volumenavanaliseret signal-støj-forhold (SNR) ved hjælp af standardpulssekvenser. Vigtige trin i prøveforberedelsen til små biologiske prøver diskuteres, samt mulige formildende faktorer såsom magnetiske følsomhedsforskelle. Anvendelserne af en optimeret magnetspole demonstreres ved høj opløsning (13 x 13 x 13 μm3,2,2 pL) 3D-billeddannelse af en rodprøve.
Magnetisk resonans billeddannelse er et alsidigt værktøj til noninvasively billede en bred vifte af biologiske prøver, der spænder fra mennesker til enkelteceller 1,2,3. Mens MR-scannere til medicinsk billedbehandling applikationer typisk bruger magneter med en feltstyrke på 1,5 T til 3 T, encellede applikationer er afbildet på meget højere felt styrker1,3,4. Studiet af prøver ved opløsninger på under hundrede mikrometer kaldes magnetisk resonansmikroskopi (MRM)5. MRM lider dog af et lavt signal-støj-forhold (SNR) sammenlignet med andre tilgængelige mikrokopi- eller billeddannelsesteknikker (f.eks. optisk mikroskopi eller CT). Der kan følges flere tilgange for at optimere SNR6. En tilgang er at bruge en højere magnetfeltstyrke, mens en supplerende tilgang er at optimere signaldetektoren til individuelle prøver. For sidstnævnte skal detektorens dimensioner justeres, så den svarer til dimensionerne af den pågældende prøve. For små prøver, der er ≈0,5-2 mm i diameter (f.eks. rodvæv), er mikrokopper nyttige, da SNR er omvendt proportional med spolens diameter6,7. Opløsninger så højt som 7,8 x 7,8 x 15 μm 3 er blevetnået på dyreceller ved hjælp af dedikerede mikrokoil8. En række mikrospole typer findes, med planar og solenoid spoler mest almindeligt anvendt afhængigt af anvendelsen og væv geometri9. Planar spoler har høj følsomhed tæt på deres overflade, hvilket er nyttigt til applikationer på tynde skiver. For eksempel er en metode designet specielt til billeddannelse perfunderet væv blevet beskrevet for planar mikrokoil10. Men planar spoler har en høj falloff af følsomhed og ingen veldefineret reference puls magt. Solenoid spoler, er cylindrisk, har et bredere område af ansøgningen og er mere begunstiget for tykkere prøver. Her beskriver vi magnetspolens egenskaber, en protokol til forberedelse af prøver til mikrospole MRI, samt kalibrering af en magnetmikroscoil (Figur 1A).
Magnetspolen består af en ledende tråd, der er spolet, som en proptrækker, omkring en kapillær, der holder prøven (Figur 1B). Mikrospolekonstruktioner kan konstrueres ved hjælp af kun emaljeret kobbertråd, et sortiment af kondensatorer og en egnet base til lodning af komponenterne (Figur 1B). De største fordele er enkelhed og lave omkostninger, kombineret med gode ydeevne egenskaber i form af SNR per enhed volumen og B1 felt homogenitet. Den nemme konstruktion muliggør hurtig iteration af coil design og geometrier. De specifikke krav til magnetmikroscoildesign og sondekarakterisering (dvs.teorien om elektronik, målinger af arbejdsborde og spektrometermålinger for en række coilgeometrier) er blevet beskrevet udførligt andre steder7,11,12,13,14.
En solenoid coil kan bygges ved at huske design regler for de ønskede dimensioner i henhold til de retningslinjer, der erbeskrevet andetsteds 15,16. I dette særlige tilfælde blev der anvendt en spole med en indre diameter på 1,5 mm, fremstillet af emaljeret kobbertråd, 0,4 mm i diameter, loopet omkring en kapillær på 1,5 mm ydre diameter. Denne magnetventil holdes på en bundplade, hvorpå der er lavet et kredsløb, bestående af en tuning kondensator (2,5 pF), en variabel matchende kondensator (1,5-6 pF) samt kobberforbindelsesledninger (Figur 1A, 1C). Tuning kondensatoren er valgt for at opnå den ønskede resonansfrekvens på 950 MHz, mens den matchende kondensator er valgt for at opnå den maksimale signaltransmission ved en impedans på 50 Ohm. Den større kondensator er variabel for at give mulighed for finere justering. Ved regelmæssig drift udføres indstilling og matchning ved hjælp af kondensatorer i sondebasen. Den samlede mikrospole skal monteres på en sonde, så den kan indsættes i magneten. Der kan være behov for en ekstra indehaver afhængigt af systemet. Her bruger vi en 22,3 T magnet kombination med en Bruker Console Avance III HD i kombination med en Micro5 sonde. I dette tilfælde brugte vi en modificeret støtteindsats udstyret med de nødvendige tilslutninger til at oprette forbindelse til sondens 1H-kanal (Figur 1A).
Spolens følsomhedsmatchet design omfatter et reservoir med perfluoreret væske for at reducere uoverensstemmelser om følsomheden, som skyldes, at kobberspolen ligger tæt påprøven 17. Et reservoir blev lavet af en plastik sprøjte til at vedlægge spolen og fyldt med fomblin. Da den perfluorerede væske skal omslutte spolen, reduceres den tilgængelige diameter for en prøve til en ydre diameter på 1 mm. For at lette prøveskift blev prøven fremstillet i kapillær med en ydre diameter på 1 mm og en indre diameter på 700 μm. De nødvendige værktøjer til prøveforberedelse er vist i figur 2A.
Grundlæggende eksperimentelle MR-parametre er meget afhængige af hardwaren i det anvendte system, herunder forløbssystem, feltstyrke og konsol. Flere parametre kan bruges til at beskrive systemets ydeevne, hvoraf 90° pulslængde og -effekt, B1-homogenitet og SNR pr. enhedsvolumen (SNR/mm3)er de mest praktisk relevante. SNR/mm3 er nyttigt til at sammenligne ydeevnen af forskellige spoler på det samme system18. Mens der kan være hardwareforskelle på tværs af systemer, letter en ensartet anvendelse af en benchmarkingprotokol også sammenligningen af systemets ydeevne.
Denne protokol fokuserer på kalibrering og prøveforberedelse. Den trinvise karakterisering af solenoid mikrokoils ydeevne er vist: kalibrering af 90 ° puls længde eller effekt; vurdering af RF-feltets homogenitet og beregning af SNR pr. volumen (SNR/mm3). En standardiseret spin-ekko måling ved hjælp af et fantom er beskrevet for at lette en sammenligning af spole design, som giver mulighed for optimering af forskellige applikationer. Fantomprøver og biologiske prøvepræparater, der er specifikke for mikrokoser, er beskrevet. Protokollen kan implementeres på enhver egnet smalboringer (≤60 mm) lodret magnet udstyret med et kommercielt tilgængeligt mikrobilledsystem. For andre systemer kan det fungere som en retningslinje og kan bruges med nogle justeringer.
Biologisk prøvepræparat til MR-målinger er normalt ikke særlig omfattende, da prøven afbildes så intakt som muligt. Luftrum i biologisk væv kan dog forårsage billedartefakter på grund af forskelle i magnetisk følsomhed19. Effekten øges med stigende magnetfeltstyrke20. Således bør luftrum undgås ved høje felt styrker, og dette kan kræve nedsænkning af prøven i en væske for at undgå luft omkring vævet og fjernelse af luftrum i vævsstrukturerne. Specifikt, når mikrokoil er ansat, excision af den ønskede prøve væv kan være påkrævet, efterfulgt af nedsænkning det i en passende væske. Dette efterfølges af indsættelse af prøven i en forskåret kapillær, og endelig forsegling kapillær med kapillær voks. Brug af voks som fugemasse i stedet for lim, flammeforsegling eller alternativer betyder, at prøven let kan ekstraheres. Denne procedure er demonstreret på roden af Medicago truncatula, en lille bælgplanter plante. En fordel ved denne protokol er muligheden for efterfølgende samregistrering af MR-data med optisk mikroskopi, da prøven ikke ødelægges under MRI-målingen.
Den præsenterede protokol er velegnet til målinger af in situ med høj rumlig opløsning, og mere omfattende design kan give mulighed for billeddannelse i vivo-prøver, hvor der skal tages fat på udfordringer i forbindelse med livsstøttesystemer.
Denne protokol er bedst egnet til biologiske prøver, da mange materialer og geologiske prøver har betydeligt kortere T2 afslapning gange, som ikke kan afbildes af de sekvenser, der anvendes her. Selv nogle biologiske væv, som udviser høj prøve magnetisk følsomhed heterogenitet, kan være svært at billedet på ultra-højt felt, da virkningerne er korreleret til feltet styrke24. Protokollen er ikke kun nyttig for nye spoler, men kan også hjælpe med fejlfinding og diagnosticering af potentielle problemer. Ved test af nye eller ukendte prøver kan denne protokol udføres på forhånd på referenceopløsningen for at kontrollere, at den eksperimentelle opsætning fungerer i overensstemmelse med specifikationerne. Dette hjælper i fejlfinding, da spektrometeret kan udelukkes som en kilde til artefakter og funktionsfejl. Desuden indstiller dette tuning og matchende kondensatorer på sonden til værdier, der er typiske for mikroscoil.
Når der ikke registreres noget signal ved det første eksperiment, kan lokaliseringsscanningens synsfelt forstørres for at kontrollere, om prøven ses. Derefter skal du kontrollere, om spolen er indstillet korrekt, igen, og forsøg en anden lokalisatorscanning. Det er muligt, at spolen udviser yderligere utilsigtede resonanstilstande, i hvilket tilfælde den korrekte skal bestemmes. Hvis der stadig ikke kan opnås et billede, fjernes prøven for at kontrollere dens position i mikroscoilsamlingen og kontrollere, at prøven er intakt (dvs. at der ikke er luftbobler eller utætheder i tætningerne). Endelig kan der fremstilles en prøve med vand i stedet for PFD. Hvis prøven giver lidt påviseligt signal i localizer scanningen, det omgivende vand i kapillær kan stadig detekteres.
Da mikrokoil ideelt set er meget tæt på prøven, kan de magnetiske følsomhedsforskelle mellem luften og ledningen forårsage yderligere signaltab, som det ses i figur 7B. Potentielle artefakter omfatter rumlig fejlmapping og unormal signalintensitet variation. Især gradient-echo type puls sekvenser påvirkes af denne ikke-ensartet signal tab. Af denne grund præsenterede vi en følsomhed-matchede spole, ved nedsænkning wiren i fluorvæske (Fomblin eller FC-43). B1-estimeringsmetoden i denne protokol kan hjælpe med at afgøre, om B1-følsomhedsforskellene berettiger til, at følsomhedsmatchningsstrategier medtages i udformningen af spolesamlingen. En alternativ metode til at konstruere en modtagelighed matchet spole er at bruge modtagelighed-matchede wire25. Desuden er der kun modtagelighed spørgsmål på grund af spolen er behandlet med denne tilgang. Uoverensstemmelser om modtagelighed i prøven (f.eks. på grund af luftrum) er fortsat udfordrende.
Luftlommer eller bobler udgør en eksperimentel udfordring, der forårsager omfattende signaltab forårsaget af følsomhedsforskelle ved luftens grænseflade og væsken ellerprøven 19 (Figur 5A). Et kritisk aspekt af vellykket prøve forberedelse er nedsænkning af både prøve og kapillær. Men selv små bobler kan forårsage signaltab, især for sekvenser af gradientekkotype. Mobile luftbobler kan migrere gennem kapillæren, indtil de er i kontakt med prøven. Nogle af disse virkninger kan afhjælpes ved lidt vippe kapillær, så den ene ende er højere end den anden. Vippe sikrer potentielle luftbobler holdes på plads i den højere ende, uden at forstyrre prøven. Det er også vigtigt at kontrollere, at kapillær voks danner en god forsegling, da dehydrering kan forårsage store luftbobler til at danne.
For luftrummene inde i prøven blev PFD anvendt til at fylde de intercellulære luftrum, uden at cellemembranerne26 blev gennemtrængende. Men selv med denne tilgang var vi ikke i stand til at fjerne alle luftrum. Derudover betyder denne tilgang, at vi har brug for en ekstra agent, som normalt ikke foretrækkes på grund af ønsket om at studere et system så noninvasively som muligt.
Kapillærernes cylindriske form betyder, at perfusionsopsætninger bør være levedygtige, især for væv, der er sårbare over for forfald, såsom biopsier eller studier af processer i levende rodmateriale. To trin kunne realisere en perfusion setup. For det første ville tilslutning af et medium tilspændingsrør samt et drænrør på hver side af kapillæren være tilstrækkelig til at skabe en kemostat. For det andet kan tilføjelsen af en fordybning i prøvekapillæren holde prøven på plads i forhold til strømningsretningen. Dette svarer til en protokol, der er udgivet for planar mikrokoiler10.
Den noninvasive karakter af MR-billeddannelse kombineret med den inaktive væske, der anvendes i denne protokol (PFD eller Fomblin), betyder, at prøverne efter afslutningen af forsøg kan fjernes fra deres kapillærer til yderligere undersøgelse. Kombinationerne omfatter optisk eller elektronmikroskopi og andre destruktive billedbehandlingsteknikker. Vi har for nylig vist en kombination med optisk mikroskopi på Medicago truncatula rodknuder27.
Vi har demonstreret en metode til billeddannelse plantemateriale ved hjælp af dedikerede mikrospoler på en ultra-høj felt NMR spektrometer. Relativt store prøvemængder kan undersøges ved høj opløsning med god RF-homogenitet. Desuden kan spektroskopisk billeddannelse udføres ved højere opløsninger end ellers muligt. Tilpasning af mikroscoildesign til prøver lettes ved hjælp af en effektiv metode til at bestemme spolens egenskaber. Solenoid coil-tilgangen kan også let anvendes på andre prøver end planter, herunder animalsk væv.
The authors have nothing to disclose.
Eksperimenterne med 950 MHz-instrumentet blev støttet af uNMR-NL, en NWO-finansieret national køreplan for storstilet facilitet i Nederlandene (projekt 184.032.207). R.S. blev støttet af BioSolarCells konsortieprojektet U2.3. J.R.K. blev støttet af Hollands Ph.d.-skole (Magnetic Resonance Research School) [022.005.029]. Vi takker Defeng Shen og Ton Bisseling for at levere Medicago truncatula prøver. Vi takker endvidere Klaartje Houben, Marie Renault og Johan van der Zwan for teknisk support på uNMR-NL anlægget. Vi vil også gerne takke Volker Lehmann, Henny Janssen og Pieter de Waard for teknisk hjælp. Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Frank Vergeldt, John Philippi og Karthick B. Sai Sankar Gupta for deres råd. Endelig takker vi Jessica de Ruiter for at give voice-over til videoen.
Reference solution preparation | |||
CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
Sample preparation | |||
Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
Syringe | Generic | – | Used to apply PFD and manipulate the sample |
Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
Imaging Hardware | |||
22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
Air cooler | Bruker GmbH | – | Used to regulate probe temperature |
Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
RF microcoil | Home-built | – | contains Fomblin |
Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |