1. Oppsett Installer R, hvis den ikke allerede er installert.MERK: PAST er skrevet i R og krever derfor at brukerne har R installert. I skrivende stund krever installasjon av PAST direkte fra Bioconductor R4.0. Eldre versjoner av PAST kan installeres fra Bioconductor for R3.6, og PAST kan installeres fra Github for brukere med R3.5. R-installasjonsinstruksjoner kan lastes ned fra følgende kobling: https://www.r-project.org/. Installer den nyeste versjonen av RStudio Desktop eller oppdater RStudio (valgfritt).MERK: RStudio er et nyttig miljø for å jobbe med R-språket. Installasjonen anbefales, spesielt for de som velger å kjøre PAST i kommandolinjen i stedet for gjennom Shiny GUI-applikasjonen. RStudio og installasjonsinstruksjonene finner du på følgende lenke: https://rstudio.com/products/rstudio/. Installer PAST fra Bioconductor11 ved å følge instruksjonene på Bioconductor.MERK: Installasjonen gjennom Bioconductor bør håndtere installasjonen av PAST’s avhengigheter. I tillegg kan PAST installeres fra Github12, men installasjon fra Github vil ikke installere avhengigheter automatisk. Installer PAST Shiny (valgfritt). Last ned filen “app. R” fra Utgivelser-siden i Github-repositoriet: https://github.com/IGBB/PAST/releases/, og husk hvor den nedlastede filen er plassert.MERK: PAST kan brukes ved å kalle metodene direkte med R, men brukere som er mindre kjent med R, kan kjøre PAST Shiny-applikasjonen, som gir et veiledet brukergrensesnitt. PAST Shiny er et R-skript tilgjengelig i shiny_app grenen av PAST Github-repositoriet. PAST Shiny vil prøve å installere avhengighetene under den første kjøringen. Begynn analysen ved å starte programmet på en av de tre måtene som er beskrevet nedenfor. PAST skinnende med RStudio Bruk RStudio til å opprette et nytt prosjekt i mappen der appen. R er plassert. Klikk Fil | Nytt prosjekt, og velg denne mappen. Når et nytt prosjekt er opprettet, åpner du appen. R-fil lastet ned tidligere. RStudio gjenkjenner den appen. R er en Shiny-app og oppretter en Kjør app-knapp på linjen over kildekoden som vises. Klikk Kjør app. RStudio vil deretter starte et vindu som viser PAST Shiny-applikasjonen. PAST skinnende med R-konsoll Start R og kjør følgende kode for å starte PAST Shiny-programmet: shiny::runApp(‘bane/til/mappe/med/skinnende/app. R’. Erstatt teksten i anførselstegn med mappen som appen skal brukes i. R ble lastet ned, og behold anførselstegnene. FORTID uten R Shiny Kjør bibliotek(PAST) i en R-konsoll for å laste INN PAST. 2. Tilpass skinnende analyse (valgfritt) Endre analysetittelen fra “Ny analyse” til noe som bedre gjenspeiler typen analyse som kjøres, noe som bidrar til å holde oversikt over flere analyser (se figur 1). Figur 1. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Endre antall kjerner og modus. Sett antall kjerner til et hvilket som helst tall mellom 1 og det totale antallet på maskinen, men vær oppmerksom på at bruk av flere ressurser til PAST kan redusere andre operasjoner på maskinen. Angi modus basert på beskrivelsen i del 6. 3. Last inn GWAS-data MERK: Kontroller at GWAS-dataene er tabulatordelt. Kontroller at tilknytningsfilen inneholder følgende kolonner: egenskap, markørnavn, locus eller kromosom, plassering på kromosomet, p-verdien og R2-verdien for markøren. Kontroller at effektfilen inneholder følgende kolonner: egenskap, markørnavn, locus eller kromosom, plassering på kromosomet og effekt. Rekkefølgen på disse kolonnene er ikke viktig, da brukeren kan angi navnene på kolonnene når dataene lastes inn. Eventuelle andre kolonner ignoreres. TASSEL13 kan brukes til å produsere disse filene. Last inn GWAS-data med PAST Shiny. Velg en tilknytningsfil og en effektfil ved hjelp av boksene Tilknytningsfil og Effektfil . Endre kolonnenavnene i boksene Navn på tilknytningskolonne og Effektkolonnenavn under filvalgboksene for å gjenspeile kolonnenavnene i dataene. Figur 2. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Last inn GWAS-data med PAST i R-konsollen. Endre og kjør følgende kode:gwas_data = load_GWAS_data(bane/til/association_file.tsv, bane/til/effects_file.tsv, association_columns = c(Trekk,, Locus, Site, p, marker_R2), effects_columns = c(Trekk,, Locus, Site, Effect) MERK: Endre banene til den faktiske plasseringen av GWAS-filene. Verdiene som er angitt for association_columns og effects_columns, er standardverdiene. Hvis navnene ikke samsvarer med standardverdiene, angir du kolonnenavnene. Ellers kan disse utelates. 4. Last inn data om koblingskoblingssikkerhet (LD) MERK: Kontroller at dataene for koblingssikkerhet (LD) er tabulatordelt og inneholder følgende typer data: Locus, Position1, Site1, Position2, Site2, Distance i basispar mellom Position1 og Position2, og R2-verdi. Last inn LD-data med PAST Shiny. Velg filen som inneholder LD-data. Endre kolonnenavnene i boksene for inndatabokser for LD-kolonnenavn under filvalgboksen slik at de samsvarer med kolonnenavnene i LD-dataene om nødvendig. Figur 3. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Last inn LD-data med PAST i R-konsollen. Endre og kjør følgende kode for å laste inn LD-data:LD = load_LD(“bane/til/LD.tsv”, LD_columns = c(“Locus1”, “Position1”, “Site1”, “Position2”, “Site2”, “Dist_bp”, “R.2”)MERK: Endre banen til den faktiske plasseringen av LD-filen. Verdiene som er angitt for LD_columns, er standardverdiene. Hvis navnene ikke samsvarer med disse standardinnstillingene, angir du de riktige navnene på kolonnene. Ellers kan disse utelates. 5. Tilordne SNPer til gener MERK: Last ned eller på annen måte finn merknader i GFF-format. Disse merknadene finnes ofte i nettdatabaser for spesifikke organismer. Vær forsiktig med merknader av lav kvalitet, da kvaliteten på merknadsdataene vil påvirke kvaliteten på baneanalysen. Kontroller at den første kolonnen i disse merknadene (kromosomet) samsvarer med formatet til locus/kromosomet i tilknytningen, effektene og LD-dataene. Merknadene bør for eksempel ikke kalle det første kromosomet “chr1” hvis GWAS- og LD-datafilene kaller det første kromosomet “1”. Tilordne SNPer til gener med PAST Shiny.MERK: Mer informasjon om å bestemme en passende R2 cutoff finnes i Tang et al.6, i avsnittet kalt “SNP til genalgoritme for baneanalysen”. Velg filen som inneholder GFF-merknader. Vurder hvilken vindusstørrelse og R2 cutoff som passer best for arten som vurderes og endres hvis standardene ikke passer til de opplastede dataene.MERK: Standardverdier i PAST gjenspeiler først og fremst verdier som passer for mais. Antall kjerner som er angitt i begynnelsen av PAST Shiny-analysen (trinn 2.2), brukes i dette trinnet. Figur 4. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Tilordne SNPer til gener med PAST i R-konsollen. Endre og kjør følgende kode for å tilordne SNPer til gener:gener = assign_SNPs_to_genes(gwas_data, LD, “bane/til/merknader.gff”, c(“gen”), 1000, 0,8, 2)MERK: I denne eksempelkoden er det gitt flere standardforslag: 1000 er størrelsen på vinduet rundt SNP for å søke etter gener; 0,8 er cutoff-verdien for R2. 2 er antall kjerner som brukes til parallell behandling. Banen til merknadene bør også endres til den faktiske plasseringen av merknadsfilen. 6. Oppdag betydelige veier MERK: Kontroller at pathways-filen inneholder følgende data i tabulatordelt format, med en linje for hvert gen i hver bane: bane-ID – en identifikator som “PWY-6475-1”; banebeskrivelse – en lengre beskrivelse av hva veiene gjør som “trans-lykopenbiosyntese”; gen – et gen i veien, som skal samsvare med navnene som er angitt i merknadene. Baneinformasjon finnes sannsynligvis i online databaser for spesifikke organismer, for eksempel MaizeGDB. Det andre brukerangitte alternativet er modusen. “Økende” refererer til fenotyper som gjenspeiler når en økende verdi av det målte trekket er ønskelig, for eksempel utbytte, mens “avtagende” refererer til et trekk der en reduksjon i de målte verdiene er gunstig, for eksempel insektskadevurderinger. Betydningen av stier testes ved hjelp av tidligere beskrevne metoder4,6,14. Oppdag viktige veier med PAST Shiny. Velg filen som inneholder banedata, og kontroller at modusen er valgt i analysealternativene. Endre om nødvendig antall gener som må være i en vei for å beholde det for analysen og antall permutasjoner som brukes til å lage nullfordelingen for å teste effektens betydning. Figur 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. MERK: Antall kjerner og modusen som er angitt i begynnelsen av PAST Shiny-analysen (trinn 2.2), brukes i dette trinnet. Standard antall gener er for tiden satt til 5 gener, så veier med færre kjente gener vil bli fjernet. Brukeren kan senke denne verdien til 4 eller 3, for å inkludere kortere veier, men dette vil risikere falske positive resultater. Å øke denne verdien kan øke analysens kraft, men vil fjerne flere veier fra analysen. Hvis du endrer antall brukte permutasjoner, økes og reduseres testens kraft. Oppdag viktige veier med PAST i R-konsollen. Endre og kjør følgende kode for å finne viktige veier:rugplots_data <- find_pathway_significance(gener, "sti/til/stier.tsv", 5, "økende", 1000, 2)MERK: I denne eksempelkoden finnes det flere foreslåtte standarder. 5 er det minste antallet gener som må være i en vei for å holde banen i analysen, økende refererer til en økende mengde av det målte trekket (det anbefales at brukeren kjører både økende og avtagende, uavhengig av egenskap; datatolkning vil variere for de to, men 1000 er antall ganger for å prøve effektene for å bestemme nullfordelingen, og 2 er antall kjerner som brukes til parallell behandling. Endre banen til den faktiske plasseringen av banefilen. 7. Se Rugplots Vis Rugplots med PAST Shiny. Når alle inndata er lastet opp og angitt, klikker du Start analyse. En fremdriftslinje vises og angir hvilket trinn i analysen som sist ble fullført. Når analysen er fullført, bytter PAST Shiny til kategorien Resultater. En tabell med resultater vises i venstre kolonne (merket “stier”) og Rugplots vises i høyre kolonne (merket “plott”). Bruk glidebryteren til å kontrollere filtreringsparameterne. Når filtreringsnivået er tilfredsstillende, klikker du last ned resultater nederst til venstre for å laste ned alle bilder og tabeller individuelt til en ZIP-fil som er navngitt med analysetittelen. Denne ZIP-filen inneholder den filtrerte tabellen, den ufiltrerte tabellen og ett bilde per bane i den filtrerte tabellen. Figur 6. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Figur 7. Klikk her for å vise en større versjon av denne illustrasjonen. Vis Rugplots med PAST i R-konsollen Endre og kjør følgende kode for å lagre resultatene:plot_pathways(rugplots_data, “pvalue”, 0,02, “økende”, “output_folder”)MERK: I denne eksempelkoden finnes det flere foreslåtte standarder. pvalue gir dataene som kan brukes til filtrering av ubetydelige veier etter at en signifikansterskel er valgt av brukeren; 0,02 er standardverdien som brukes i filtrering, og økende refererer til en økende mengde av det målte trekket (det anbefales at brukeren kjører både økende og avtagende, uavhengig av egenskap; datatolkning vil variere for de to, men); output_folder er mappen der bildene og tabellene skal skrives (denne mappen må finnes før du kjører funksjonen). En tabell med filtrerte resultater, ufiltrerte resultater og enkeltbilder for hver bane i de filtrerte resultatene skrives til denne mappen.