Et høygjennomstrømningsbildestyrt stereotaktisk nevronavigering og fokusert ultralydsystem for blod-hjernebarriereåpning hos gnagere

Summary

Blod-hjernebarrieren (BBB) kan midlertidig forstyrres med mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS). Her beskriver vi en trinnvis protokoll for høy gjennomstrømning BBB-åpning in vivo ved hjelp av et modulært FUS-system tilgjengelig for ikke-ultralydeksperter.

Abstract

Blod-hjernebarrieren (BBB) har vært et stort hinder for behandling av ulike hjernesykdommer. Endotelceller, forbundet med tette veikryss, danner en fysiologisk barriere som hindrer store molekyler (>500 Da) i å komme inn i hjernevevet. Mikrobubble-mediert fokusert ultralyd (FUS) kan brukes til å indusere en forbigående lokal BBB-åpning, slik at større stoffer kan komme inn i hjernen parenchyma.

I tillegg til store kliniske enheter for klinisk oversettelse, krever preklinisk forskning for terapiresponsvurdering av legemiddelkandidater dedikerte små dyre ultralydoppsett for målrettet BBB-åpning. Fortrinnsvis tillater disse systemene arbeidsflyter med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og integrert kavitasjonsovervåking, samtidig som de er kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader.

Her presenterer vi et bioluminescens- og røntgenstyrt stereotaktisk fus-system for små dyr som er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og oppfyller de nevnte kravene. Det er lagt særlig vekt på en høy grad av automatisering som letter utfordringene som typisk oppstår i prekliniske evalueringsstudier med høyt volum. Eksempler på disse utfordringene er behovet for standardisering for å sikre datareduserbarhet, redusere variasjon i intragruppen, redusere utvalgsstørrelsen og dermed overholde etiske krav og redusere unødvendig arbeidsbelastning. Det foreslåtte BBB-systemet er validert i omfanget av BBB-åpningen tilrettelagte legemiddelleveringsforsøk på pasientavledede xenograftmodeller av glioblastom multiforme og diffuse midline glioma.

Introduction

Blod-hjernebarrieren (BBB) er et stort hinder for legemiddellevering i hjernen parenchyma. De fleste terapeutiske legemidler som er utviklet, krysser ikke BBB på grunn av deres fysisk-kjemiske parametere (f.eks. lipofilitet, molekylvekt, hydrogenbindings akseptorer og donorer) eller beholdes ikke på grunn av deres affinitet for eflukstransportører i hjernen^1,2. Den lille gruppen medikamenter som kan krysse BBB er vanligvis små lipofile molekyler, som bare er effektive i et begrenset antall hjernesykdommer^1,2. Som en konsekvens, for de fleste hjernesykdommer, er farmakologiske behandlingsalternativer begrenset og nye legemiddelleveringsstrategier er nødvendige^3,4.

Terapeutisk ultralyd er en ny teknikk som kan brukes til forskjellige nevrologiske applikasjoner som BBB-forstyrrelse (BBBD), nevromodulering og ablasjon^4,5,6,7. For å oppnå en BBB-åpning med en ekstrakorporeal ultralydemitter gjennom kraniet, kombineres fokusert ultralyd (FUS) med mikrobobler. Mikrobubble-mediert FUS resulterer i økt biotilgjengelighet av legemidler i hjernen parenchyma^5,8,9. I nærvær av lydbølger begynner mikrobobler å svinge initiere transcytose og forstyrrelse av de tette kryssene mellom endotelcellene i BBB, noe som muliggjør paracellulær transport av større molekyler¹⁰. Tidligere studier bekreftet sammenhengen mellom intensiteten av det akustiske utslippet og den biologiske effekten på BBB-åpningen^11,12,13,14. FUS i kombinasjon med mikrobobler har allerede blitt brukt i kliniske studier for behandling av glioblastom ved bruk av temozolomid eller liposomal doksorubicin som kjemoterapeutisk middel, eller til behandling av Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose^5,9,15,16.

Siden ultralydmediert BBB-åpning resulterer i helt nye muligheter for farmakoterapi, er preklinisk forskning for klinisk oversettelse nødvendig for å vurdere behandlingsresponsen til utvalgte legemiddelkandidater. Dette krever vanligvis en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning med både høy romlig presisjon og helst en integrert kavitasjonsdeteksjon for overvåking av målrettet BBB-åpning med høy reproduserbarhet. Hvis det er mulig, må disse systemene være kostnadseffektive i både innledende investeringer og driftskostnader for å kunne skaleres i henhold til studiestørrelsen. De fleste prekliniske FUS-systemer kombineres med MR for image-veiledning og behandlingsplanlegging^15,17,18,19. Selv om MR gir detaljert informasjon om tumoranatomien og volumet, er det en dyr teknikk, som vanligvis utføres av trente / dyktige operatører. I tillegg kan høyoppløselig MR ikke alltid være tilgjengelig for forskere i prekliniske anlegg og krever lange skannetider per dyr, noe som gjør den mindre egnet for farmakologiske studier med høy gjennomstrømning. Bemerkelsesverdig er at for preklinisk forskning innen nevro-onkologi, spesielt infiltrative tumormodeller, er muligheten til å visualisere og målrette svulsten avgjørende for behandlingssuksess²⁰. For tiden er dette kravet bare oppfylt av MR eller av svulster transdusert med et fotoprotein, noe som muliggjør visualisering med bioluminescensavbildning (BLI) i kombinasjon med administrering av fotoproteinunderlaget.

MR-styrte FUS-systemer bruker ofte et vannbad for å sikre ultralydbølgeutbredelse for transkranielle applikasjoner, hvorved dyrets hode er delvis nedsenket i vannet, de såkalte ”bottom-up” systemene^15,17,18. Selv om disse designene generelt fungerer godt i mindre dyrestudier, er de et kompromiss mellom dyreforberedelsestider, bærbarhet og realistisk vedlikeholdbare hygieniske standarder under bruk. Som et alternativ til MR omfatter andre veiledningsmetoder for stereotaktisk navigasjon bruk av et anatomisk gnageratlas^21,22,23, laserpekerassistert visuell observasjon²⁴, pinhole-assistert mekanisk skanneenhet²⁵eller BLI²⁶. De fleste av disse designene er “ovenfra og ned” -systemer der svingeren er plassert på toppen av dyrets hode, med dyret i en naturlig posisjon. Arbeidsflyten ”ovenfra og ned’ består av enten et vannbad^22,25,26 eller en vannfylt kjegle^21,24. Fordelen med å bruke en svinger i en lukket kjegle er det mer kompakte fotavtrykket, kortere oppsettstid og rett frem dekontamineringsmuligheter som forenkler hele arbeidsflyten.

Samspillet mellom det akustiske feltet med mikroboblene er trykkavhengig og spenner fra lav-amplitude oscillasjoner (referert til som stabil kavitasjon) til forbigående boblekollaps (referert til som inertiell kavitasjon)^27,28. Det er en etablert konsensus om at ultralyd-BBBD krever et akustisk trykk godt over den stabile kavitasjonsterskelen for å oppnå vellykket BBBD, men under den inertiske kavitasjonsterskelen, som generelt er forbundet med vaskulær / nevronskade²⁹. Den vanligste formen for overvåking og kontroll er analysen av det (bak)spredte akustiske signalet ved hjelp av passiv kavitasjonsdeteksjon (PCD), som foreslått av McDannold et al.¹². PCD er avhengig av analysen av Fourier-spektraet av mikrobubble utslippssignaler, der styrken og utseendet til stabile kavitasjonsmerker (harmonikk, subharmonikk og ultraharmonikk) og inertial kavitasjonsmarkører (bredbåndsrespons) kan måles i sanntid.

En “one size fits all” PCD-analyse for presis trykkkontroll er komplisert på grunn av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillasjonsamplituden avhenger sterkt av boblediameteren), forskjellene i bobleskallegenskaper mellom merker og akustisk oscillasjon, som avhenger sterkt av frekvens og trykk^30,31,32. Som en konsekvens er det foreslått mange forskjellige PCD-deteksjonsprotokoller, som er tilpasset bestemte kombinasjoner av alle disse parametrene og har blitt brukt i ulike applikasjonsscenarier (alt fra in vitro-eksperimentering over små dyreprotokoller til PCD for klinisk bruk) for robust kavitasjonsdeteksjon og til og med for tilbakevirkende tilbakemeldingskontroll av trykket^{11,14,30,31,32,33,34,35}. PCD-protokollen som brukes i omfanget av denne studien er avledet direkte fra McDannold et al.¹² og overvåker det harmoniske utslippet for tilstedeværelse av stabil kavitasjon og bredbåndsstøy for inertiell kavitasjonsdeteksjon.

Vi har utviklet et bildestyrt neuronavigation FUS-system for forbigående åpning av BBB for å øke legemiddeltilførselen til hjerneparenchyma. Systemet er basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og kan enkelt tilpasses flere forskjellige bildemodaliteter, avhengig av tilgjengelige bildeteknikker i dyreanlegget. Siden vi trenger en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning, har vi valgt å bruke røntgen og BLI til bildeveiledning og behandlingsplanlegging. Tumorceller transdusert med fotoprotein (f.eks. luciferase) er egnet for BLI-avbildning²⁰. Etter administrering av fotoprotein substratet kan tumorceller overvåkes in vivo og tumorvekst og plassering kan bestemmes^20,36. BLI er en rimelig bildebehandlingsmodalitet, det gjør det mulig å følge svulstveksten over tid, den har raske skannetider og det korrelerer godt med tumorvekst målt med MR^36,37. Vi har valgt å erstatte vannbadet med en vannfylt kjegle festet til svingeren for å muliggjøre fleksibilitet til fritt å flytte plattformen som gnageren er montert^{på 8,24}. Designet er basert på en avtakbar plattform utstyrt med integrasjon av (I) smådyr stereotaktiske plattform (II) fiducial markører med både røntgen- og optisk bildekompatibilitet (III) hurtigavtakbar anestesimaske, og (IV) integrert temperaturregulert dyreoppvarmingssystem. Etter den første induksjonen av anestesi, er dyret montert i en presis posisjon på plattformen der den forblir under hele prosedyren. Følgelig passerer hele plattformen alle stasjoner i arbeidsflyten for hele intervensjonen, samtidig som den opprettholder en nøyaktig og reproduserbar posisjonering og vedvarende anestesi. Kontrollprogramvaren tillater automatisk deteksjon av fiducial markører og registrerer automatisk alle typer bilder og bildemodaliteter (dvs. mikro-CT, røntgen, BLI og fluorescensavbildning) i referanserammen til den stereotaktiske plattformen. Ved hjelp av en automatisk kalibreringsprosedyre er fokuslengden på ultralydtransduseren nettopp kjent innen, noe som muliggjør automatisk fusjon av intervensjonsplanlegging, akustisk levering og oppfølgingsavbildningsanalyse. Som vist i figur 1 og figur 2, gir dette oppsettet en høy grad av fleksibilitet til å designe dedikerte eksperimentelle arbeidsflyter og tillater sammenflettet håndtering av dyret på forskjellige stasjoner, noe som igjen letter eksperimenter med høy gjennomstrømning. Vi har brukt denne teknikken for vellykket legemiddellevering i mus xenografts av høyverdig glioma som diffus midline glioma.

Protocol

Alle in vivo-eksperimenter ble godkjent av den nederlandske etiske komiteen (lisenstillatelsesnummer AVD114002017841) og Dyrevelferdsorganet til Vrije Universiteit Amsterdam, Nederland. Etterforskerne ble opplært i det grunnleggende i FUS-systemet for å minimere ubehaget til dyrene. 1. Fokusert ultralydsystem MERK: Det beskrevne oppsettet er et innebygd BBB-avbruddssystem basert på kommersielt tilgjengelige komponenter og inkluderer en 3D-trykt skreddersydd kjegle …

Representative Results

Det beskrevne FUS-systemet (figur 1 og figur 2) og den tilhørende arbeidsflyten har blitt brukt i over 100 dyr og produsert reproduserbare data om både friske og tumorbærende mus. Basert på den registrerte kavitasjonen og spektraltettheten ved harmonikken i det største øyeblikket av mikrobubble bolusinjeksjonen, kan spektralkraften til hver frekvens beregnes ved hjelp av Fourier-analysen som forklart i trinn 4 i protokollen. Basert på den akustiske protok…

Discussion

I denne studien utviklet vi et kostnadseffektivt bildestyrt basert FUS-system for forbigående BBB-forstyrrelser for økt legemiddellevering i hjerneparenchyma. Systemet ble i stor grad bygget med kommersielt tilgjengelige komponenter og i forbindelse med røntgen og BLI. Modulariteten til den foreslåtte utformingen tillater bruk av flere bildemodaliteter for planlegging og vurdering i arbeidsflyter med høy gjennomstrømning. Systemet kan kombineres med mer omfattende høyoppløselige 3D-avbildningsmodaliteter, for eks…

Materials

1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g