2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

Ning Zhang; Shundi Shi; Barney Yoo; Xiaohong Yuan; Wenjia Li; Shenglong Zhang

doi:10.3791/61281

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Articolo metodologico

2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

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DOI:

10.3791/61281

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10 luglio 2020

Ning Zhang¹^,² , Shundi Shi² , Barney Yoo³ , Xiaohong Yuan¹ , Wenjia Li⁴ , Shenglong Zhang¹

¹Department of Biological and Chemical Sciences, New York Institute of Technology, ²Department of Chemical Engineering, Columbia University, ³Department of Chemistry, Hunter College, City University of New York, ⁴Department of Computer Science, New York Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (<35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.

Abstract

Gli approcci di sequenziamento basati sulla spettrometria di massa (MS) si sono dimostrati utili nel sequenziamento diretto dell'RNA senza la necessità di un intermedio di DNA complementare (cDNA). Tuttavia, tali approcci sono raramente applicati come metodo di sequenziamento dell'RNA de novo , ma utilizzati principalmente come strumento che può aiutare a garantire la qualità per confermare sequenze note di campioni di RNA purificati a singolo filamento. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di sequenziamento diretto dell'RNA integrando una strategia di marcatura idrofobica del tempo di ritenzione della massa bidimensionale nel sequenziamento basato su MS (2D-HELS MS Seq). Questo metodo è in grado di sequenziare con precisione singole sequenze di RNA e miscele contenenti fino a 12 sequenze di RNA distinte. Oltre ai quattro ribonucleotidi canonici (A, C, G e U), il metodo ha la capacità di sequenziare oligonucleotidi di RNA contenenti nucleotidi modificati. Ciò è possibile perché la base nucleotica modificata ha una massa intrinsecamente unica che può aiutare nella sua identificazione e nella sua posizione nella sequenza di RNA, oppure può essere convertita in un prodotto con una massa unica. In questo studio, abbiamo utilizzato l'RNA, incorporando due nucleotidi modificati rappresentativi (pseudouridina (Ψ) e 5-metilcitosina (m⁵C)), per illustrare l'applicazione del metodo per il sequenziamento de novo di un singolo oligonucleotide di RNA e di una miscela di oligonucleotidi di RNA, ciascuno con una sequenza diversa e/o nucleotidi modificati. Le procedure e i protocolli qui descritti per sequenziare questi RNA modello saranno applicabili ad altri campioni di RNA corti (<35 nt) quando si utilizza un sistema LC-MS standard ad alta risoluzione e possono anche essere utilizzati per la verifica della sequenza di oligonucleotidi di RNA terapeutici modificati. In futuro, con lo sviluppo di algoritmi più robusti e con strumenti migliori, questo metodo potrebbe consentire il sequenziamento di campioni biologici più complessi.

Introduzione

Per il sequenziamento diretto dell'RNA sono stati sviluppati metodi di sequenziamento basati sulla spettrometria di massa (MS), tra cui MS top-down e MS 1,2,3,4 in tandem. Tuttavia, le tecniche di frammentazione in situ per generare efficacemente scale di RNA di alta qualità negli spettrometri di massa attualmente non possono essere applicate al sequenziamento de novo ^5,6. Inoltre, non è molto banale analizzare i tradizionali dati M....